Supresión del hepatocarcinoma establecido en inmunoterapia adyuvante únicamente: el alumbre desencadena anti

Aug 14, 2023

Scientific Reports volumen 5, número de artículo: 17695 (2015) Citar este artículo

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La inmunoterapia basada en células dendríticas es una nueva arma en nuestra batalla contra las neoplasias malignas en humanos. Ensayos recientes en humanos y trabajos de investigación en animales modelo han mostrado diversos grados de éxito, lo que sugiere su gran potencial para uso clínico. Si bien los protocolos varían, un esquema común en esta categoría de tratamiento implica la activación de células dendríticas, con el propósito de aumentar la presentación de antígenos y la inmunidad celular. Por tanto, el uso adecuado del adyuvante inmunológico es un tema central de estudio. Presentamos aquí un hallazgo inesperado de que la inyección de alumbre, el adyuvante humano más utilizado, en ratones portadores de hepatocarcinoma H22 resultó en una reducción significativa del crecimiento tumoral con una supervivencia animal prolongada. Este efecto se asoció con una mayor activación específica de las células T CD8+ y un entorno inflamatorio, aunque con efectos secundarios mínimos. Nuestro hallazgo sugiere que el uso de adyuvante solo en ciertos tumores establecidos puede invocar una activación inmune protectora del huésped contra el mismo objetivo, lo que puede ser valioso en nuestro desarrollo de nuevas inmunoterapias contra el cáncer.

La inmunoterapia del cáncer ha sido considerada como uno de los avances biomédicos de los últimos años1. El objetivo de la inmunoterapia es invocar respuestas inmunes del huésped para controlar y, en casos óptimos, erradicar la neoplasia, lo que, a diferencia del tratamiento tumoral convencional, es seguro y tiene menos efectos secundarios. Actualmente se están llevando a cabo más de mil ensayos clínicos bajo esta categoría2 (datos extraídos de www.clinicaltrials.gov). Entre ellas, las vacunas basadas en células dendríticas son las más estudiadas3,4,5.

A diferencia de la vacunación profiláctica mediante la cual se induce una respuesta inmune del huésped en preparación para futuros encuentros con agentes infecciosos, la inmunoterapia contra el cáncer tiene como objetivo romper el estado de tolerancia hacia los antígenos presentes de manera errática o excesivamente expresados ​​en las células tumorales6. La ACT implica la expansión in vitro de células T del huésped estimuladas por antígenos tumorales, en ausencia de factores inhibidores in vivo, y la reinfusión de estas células en el huésped para la citólisis y la inducción de la apoptosis del tumor7,8. Esfuerzos más recientes aplican tecnologías de ingeniería biomédica mediante las cuales se expresan receptores específicos de antígenos tumorales en los linfocitos infundidos para lograr un reconocimiento más sólido9,10. El bloqueo de los puntos de control inmunológico aprovecha algunas tácticas comunes utilizadas por los tejidos cancerosos para protegerse de la detección inmunológica, particularmente mediante la señalización de reguladores inmunológicos negativos de la superficie celular. Los anticuerpos contra CTLA-4 se han utilizado con éxito en el tratamiento del melanoma metastásico11,12,13. El bloqueo de la señalización PD-1/PD-L1 también ha demostrado una gran eficacia en el tratamiento de lesiones malignas inducidas por el virus del papiloma y una lista de otros tumores sólidos3,14. Si bien estos protocolos tienen un gran potencial, no están exentos de peligros. ACT adolece de dificultades en la identificación de antígenos y desafíos técnicos en la expansión de las células inmunes15,16, el bloqueo de los puntos de control solo es aplicable en un número limitado de tumores sólidos10 y a menudo se asocia con autoinmunidad, incluidas colitis y dermatitis17,18. La inmunoterapia basada en DC, cuyo objetivo es aumentar la intensidad y amplitud de la presentación del antígeno, sigue siendo una alternativa válida.

Las células dendríticas presentan constantemente antígenos endógenos del huésped a las células T que, en ausencia de señales de peligro, sirven como mecanismo de inducción de tolerancia periférica19. En este contexto se presentan antígenos tumorales. En el entorno tumoral, a menudo están presentes regulaciones negativas adicionales, incluidos macrófagos asociados a tumores y citoquinas supresoras como TGFβ20,21,22. En este caso, el adyuvante adquiere una importancia crítica para desencadenar la activación de las CD23. Los adyuvantes, que se efectúan a través de TLR/NLR, inducción de fagocitosis o alteración de la membrana de las DC, a menudo inducen una fuerte activación de las DC, lo que conduce a una presentación robusta del antígeno, la expresión de moléculas coestimuladoras y la secreción de citocinas inflamatorias24,25,26. Las vacunas basadas en DC se pueden dividir aproximadamente en tres categorías. Las CD aisladas del huésped o/y expandidas in vitro pueden cargarse con antígenos tumorales (péptidos epítopos o lisados ​​tumorales autólogos) en presencia de adyuvante y reinfundirse en el huésped27,28. Un enfoque más específico utiliza células tumorales diseñadas para expresar GM-CSF para atraer específicamente las CD in vivo29. Más recientemente, se han fusionado antígenos tumorales con anticuerpos que reconocen específicamente marcadores de superficie de DC, como DEC205, DNGR1, CD40, etc., para una mejor orientación, logrando a menudo una respuesta inmune en ausencia de adyuvante adicional30,31,32. El protocolo más básico/pasivo utiliza antígenos tumorales mezclados con adyuvante con la esperanza de que las CD capturen y presenten esos antígenos tras la estimulación33,34. Conceptualmente, dado que las CD presentan constantemente antígenos de tumores establecidos, lo que conduce a una tolerancia inmune en ausencia de activación de las CD, la estimulación adecuada de las CD puede, en teoría, revertir la inhibición e invocar la inmunidad tumoral.

Presentamos aquí un hallazgo inesperado de que en ratones Balb/c con un hepatocarcinoma H22 establecido, un protocolo de inyecciones repetidas de alumbre invocó una respuesta inmune específica del tumor que inhibió significativamente el crecimiento y la mortalidad del tumor. Esta respuesta dependió críticamente del sistema inmunológico adoptivo, particularmente de las células T CD8+ y, en menor medida, de los neutrófilos. Es importante destacar que este protocolo provocó poca inflamación sistémica y daño tisular. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la administración de adyuvante solo en huéspedes portadores de tumores puede conducir a la supresión del tumor, probablemente a través de la activación no específica de las CD. Dado que el alumbre es un adyuvante bien tolerado, nuestros resultados implican su uso potencial en el tratamiento de tumores.

En nuestros intentos de observar el alumbre como adyuvante para estimular la respuesta antitumoral contra una línea de hepatoma Balb/c H22 inicialmente establecida a partir de un modelo metastásico linfático35, inmunizamos ratones portadores de tumores H22 con varios lisados ​​de células tumorales isogénicas en combinación con alumbre para detectar cualquier posible efecto terapéutico. Notamos una reducción ocasional del tamaño del tumor en el grupo de alumbre solo en ausencia de antígeno tumoral (lisado tumoral). Para establecer un protocolo que capture este efecto de manera más consistente, configuramos una serie de experimentos para identificar el programa de vacunación óptimo. En la figura 1A se describe un esquema representativo. Primero se inocularon ip células de hepatocarcinoma H22 en ratones Balb/c, se recogió el lavado peritoneal y se inyectaron sc 105 células del lavado en nuevos receptores. 5, 7 o 10 días después, se inyectaron ip 250 μg de Al(OH)3 en 250 μl de PBS o PBS solo en los ratones inoculados, seguido del mismo tratamiento cada tres o cuatro días para un total de 6 inyecciones (Fig. .1A). En todos los esquemas de tratamiento con alumbre, los iniciados 7 o 10 días después de la inoculación del tumor mostraron un aumento del volumen del tumor similar al control de PBS. Curiosamente, el tratamiento iniciado 5 días después (alumbre 5DPI) mostró una reducción significativa del crecimiento, y las diferencias se hicieron mayores con el tiempo (Fig. 1B). Luego seleccionamos este cronograma para análisis más detallados. De acuerdo con el hallazgo inicial, los tumores extirpados de los ratones tratados con alumbre 5DPI 25 días después de la inoculación eran visiblemente más pequeños que el control de PBS (Fig. 1C, D). Esto estuvo acompañado de una ventaja de supervivencia estadísticamente significativa ya que no quedó ningún ratón en el grupo de PBS en el día 54, en contraste con una tasa de supervivencia del 50% en el grupo de alumbre 5DPI (Fig. 1E). Aunque el potencial de crecimiento in vivo del H22 cambió con el tiempo probablemente como consecuencia del cultivo celular que resultó en tasas de crecimiento ligeramente diferentes de un experimento a otro, este resultado sugiere que la inyección de alumbre sola, administrada después del establecimiento del hepatocarcinoma, en comparación con el control con PBS, conduce a una supresión inesperada del crecimiento tumoral.

El tratamiento con alumbre solo inhibe el crecimiento del tumor H22.

Se inocularon sc a grupos de ratones hembra Balb/c (siete por grupo) con 105 por ratón de células tumorales H22 el día 0. A los ratones portadores de tumores se les inyectó ip 0,25 mg/250 ul de Al(OH)3 o 250 ul de PBS, dos veces. semanalmente durante 3 semanas consecutivas. (A) Una representación esquemática del protocolo de tratamiento. (B) Gráfico de líneas que representa el volumen del tumor en ratones con tumores H22 que reciben diferentes tratamientos a lo largo del tiempo. (C) Cambios en el volumen del tumor en ratones portadores de tumores H22 tratados con Al(OH)3 o PBS a partir del quinto día. (D) Fotos de tumores de ratones sacrificados y tumores sólidos aislados el día 22. (E) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de cada grupo. Cada valor representa la media ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 y ****p < 0,0001. Las comparaciones no marcadas no son estadísticamente significativas.

Para probar los cambios inmunológicos asociados con la supresión tumoral en la Fig. 1, seguimos el perfil de citocinas en el lavado peritoneal y el homogeneizado tumoral a lo largo del tiempo. La Figura 2A muestra que IL-1β e IL-6 estaban ligeramente elevadas en el lavado de los ratones alumbre 5DPI en comparación con el control de PBS, aunque las cantidades absolutas eran bastante bajas. Por el contrario, las cantidades de IL-1β y TNFα aumentaron en los grupos tratados con alumbre (Fig. 2B), lo que sugiere que el tratamiento está asociado con una respuesta inflamatoria mejorada.

Activación inmune mejorada en ratones portadores de tumores tratados con alumbre 5DPI.

Se inocularon ratones Balb/c sc con 105 células H22 y se dividieron aleatoriamente en dos grupos 5 días después. Los ratones fueron tratados con Al(OH)3 como se indica. Se recogieron líquido de lavado peritoneal y líquido intersticial tumoral 3 días después de la primera, tercera y sexta inyección de alumbre. Los niveles de IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-10 en el peritoneo (A) y el tumor (B) se analizaron mediante ELISA. (C) Se inocularon ratones desnudos con 105 células H22 y se trataron con Al(OH)3 o PBS. Gráfico de líneas que representa el volumen del tumor en ratones desnudos portadores de tumores H22 que reciben tratamiento con alumbre o control. (D) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones desnudos portadores de tumores H22. Cada valor representa la media ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01. Las comparaciones no marcadas no son estadísticamente significativas.

El alumbre se administró espacio-temporalmente lejos de la inoculación del tumor H22. Por defecto, la presencia de estructuras particuladas o cristalinas puede activar respuestas inmunes innatas, particularmente como consecuencia de la interacción con los fagocitos. Fue de gran interés si la supresión de tumores mediada por alumbre también requería inmunidad adaptativa. Para ello, llevamos a cabo el experimento de la Fig. 1 en ratones Balb/c desnudos. Las Figuras 2C y D muestran que el beneficio protector obtenido por el alumbre se perdió en ausencia de inmunidad celular, según lo evaluado por el tamaño del tumor o la mortalidad.

El control de la patogénesis neoplásica por parte de la inmunidad celular es muy complejo. Si bien las células T CD8+ pueden ejercer su efecto a través de la citólisis y la inducción de apoptosis, las células T CD4+ también se reconocen cada vez más como un factor importante que modula la producción de citocinas y el microambiente tumoral36, además de un subconjunto de estas células, las células T reguladoras, que sirven como factor de equilibrio. Los días 6, 9, 13, 16, 20 y 23 después de la inoculación, infundimos ip anticuerpos bloqueantes contra CD8, CD4 y el marcador de neutrófilos Ly6G en ratones tratados con alumbre 5DPI. La Figura 3A muestra que el agotamiento de las células T CD3+ o CD8+ eliminó esencialmente el efecto protector; mientras que la eliminación de células T CD4+ produjo una reducción marginal, estadísticamente insignificante, de la protección. El agotamiento de los neutrófilos también resultó en una reversión intermedia de la protección. Para confirmar el papel de las células T CD8+, se recolectaron linfocitos de los grupos tratados con alumbre 5DPI después de tres inyecciones y se estimularon con lisado tumoral H22. La expansión de las células T CD8+ se analizó mediante FACS y el índice de división (relación de expansión en presencia respecto a ausencia de lisado tumoral) se representó gráficamente en la Fig. 3B. Claramente, los linfocitos T CD8+ en los ratones tratados con alumbre mostraron una expansión sustancial, en comparación con el control de PBS. Si bien en general el porcentaje no cambió en la sangre, incluso disminuyó ligeramente en los LN que drenaron el sitio de inoculación, una gran cantidad de células T CD8+ se infiltraron en el tumor en el grupo de alumbre (Fig. 3C). De acuerdo con la menor participación de las células T CD4+, no se observaron cambios para las células T CD4+ en estas ubicaciones (Fig. 3D). Por lo tanto, los ratones tratados con alumbre muestran una inmunidad mejorada de las células T CD8+ específicas del tumor H22, mientras que la respuesta de las células T CD4+ no parece ser crítica. No pudimos detectar células NK significativas en el tumor (cerca o menos del 1%). Por otro lado, las células Treg aparecieron en mayor número el día 15 en el control de PBS en comparación con el grupo tratado con alumbre, lo que sugiere que el alumbre podría suprimir el aumento de células Treg en el entorno de crecimiento tumoral (Figura 1 complementaria).

Las células T CD8+ son esenciales para la supresión de tumores inducida por alumbre.

(A) Se inocularon ratones Balb/c sc con células H22 y se trataron con Al(OH)3 o PBS. A ratones portadores de tumores se les inyectaron ip 100 μg de anticuerpo de control de isotipo anti-Ly6G, anti-CD8 de ratón o IgG2a κ de rata en 200 μl de PBS 1 día después de cada inyección de Al(OH)3. El volumen del tumor se midió cada 3 días. (B) Se recolectaron LN drenantes de ratones portadores de tumores en grupos tratados con PBS y Al(OH)3 15 días después de la inoculación del tumor. Se prepararon suspensiones de células individuales, se marcaron con colorante de proliferación celular eFluor 670 y se estimularon con 10 μg/ml de lisis celular (proteína) H22 durante 72 h y se analizaron mediante FACS. Se recogieron sangre periférica, bazo, LN drenantes y tumores de ratones portadores de tumores 3 días después de la primera, tercera y sexta inyección. Los porcentajes de células T CD8+ (C) y CD4+ (D) en células T totales o en células totales se analizaron mediante FACS. Los valores de P para las células D15 CD8+ y CD4+ en los ganglios linfáticos de drenaje y las células CD8+ en el tumor son 0,035, 0,045 y 0,047 respectivamente.

Para analizar globalmente cómo el tratamiento con alumbre afecta el tumor H22, se estudió un perfil de expresión genética de un tumor recuperado quirúrgicamente 15 días después de la inoculación mediante análisis de chips genéticos de microarrays. Después del tratamiento con alumbre, hubo 364 genes expresados ​​diferencialmente (Figura complementaria 2). Entre estos genes, 20 estaban regulados positivamente. Todos estos genes se pueden dividir en cuatro categorías: 1. supresión de la tumorigenicidad, como St14 (Suppression of Tumorigenicity 14)37; 2. regulación inmune, como Wif1 (Wnt Inhibitory Factor 1)38; 3. inducción de apoptosis e inhibición de la proliferación, como Dapk2 (proteína quinasa 2 asociada a la muerte) 39, Gas-1 (detención del crecimiento específico 1) 40; 4. infecciones antimicrobianas, como Ear2 (ribonucleasa 2 asociada a eosinófilos), 10, 12 y 4B41,42 (fig. 4A). Aunque el impacto inmediato de estas regulaciones genéticas no estaba claro en los ratones tratados con alumbre y no se detectaron factores como los cambios de quimiocinas (ver más abajo), este ensayo mostró, no obstante, un perfil diferente que sugiere supresión tumoral en esos ratones.

Cambios en la regulación genética y la producción de quimiocinas después del tratamiento con Al(OH)3.

(A) Mapas de calor que muestran la agrupación jerárquica de muestras a lo largo de genes en un orden fijo para muestras de tumores en grupos tratados con PBS y Al(OH)3. Los tumores se recogieron de ratones portadores de tumores 15 días después de la inoculación. El ARN total se extrajo y cuantificó como se describe en los métodos. La comparación entre dos grupos se realizó utilizando tres réplicas biológicas. Se muestran transcripciones clasificadas como relacionadas con la supresión tumoral y aquellos niveles de expresión significativamente diferentes entre dos grupos. (B,C) Se inocularon ratones Balb/c con 105 células H22, 5 días después, los ratones portadores de tumores se dividieron aleatoriamente en dos grupos. Se recogieron líquido de lavado peritoneal y líquido intersticial tumoral de ratones 3 días después de la primera, tercera y sexta inyección. CCL2, CXCL9 y CCL5 en el peritoneo (B) y el líquido tumoral (C) se analizaron mediante ELISA. Cada valor representa la media ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Las comparaciones no marcadas no son estadísticamente significativas.

Razonamos que la infiltración de células T CD8+ en el tumor era el resultado de cambios quimiotácticos. Se controlaron los lavados peritoneales y los lisados ​​del tumor recuperado para determinar los niveles de CCL2, CCL9 y CCL5. La Figura 4B muestra que todas estas quimiocinas estaban presentes en mayores cantidades en el grupo tratado con alumbre, al menos el día 15 después de la inoculación del tumor. Curiosamente, solo se encontró que CCL2 estaba elevado en el lisado tumoral el día 15, de acuerdo con la capacidad de esta quimiocina para atraer células T CD8+ (Fig. 4C). Dado que apareció bastante tarde, este aumento sugirió una mayor infiltración monocítica concomitante con una mayor respuesta de CD8 hacia el final del programa de tratamiento.

En la Fig. 3A, el tratamiento con anticuerpo Ly6G condujo a una inversión perceptible del efecto antitumoral del alumbre. A diferencia de las células T CD8+ específicas de antígenos tumorales, la asociación de neutrófilos y tumores es más compleja. Si bien en general se cree que estas células ayudan a formar un microambiente que favorece el crecimiento, promoviendo así el tumor, estudios más recientes sugieren que en algunos casos también matan células tumorales43,44,45. En el grupo tratado con alumbre, hubo pocos cambios en el número general de neutrófilos en la sangre; sin embargo, estaban elevados en el tumor, lo que sugiere que el alumbre favorece un ambiente proinflamatorio (Fig. 5A). Para ver si las células reclutadas eran más eficientes a la hora de inducir la muerte de las células tumorales, se utilizaron neutrófilos recuperados de la sangre en un ensayo de cocultivo con células H22. Claramente, los neutrófilos de los ratones tratados con alumbre fueron mucho más eficientes para mediar el recambio de anexina V en las células diana que los del grupo PBS (Fig. 5B), en línea con la reducción de la supresión tumoral cuando se usó el anticuerpo Ly6G para agotar esta población. .

Neutrófilos en tumor.

(A) A ratones con tumores establecidos se les inyectó ip Al(OH)3 o PBS. Se recogieron sangre periférica, bazo, LN drenantes y tumores de ratones portadores de tumores el día 3 después de la primera, tercera y sexta inyecciones. FACS detectó el porcentaje de neutrófilos en células derivadas de mieloides o en células totales del bazo, drenaje de LN y tumor. (B) Los neutrófilos se purificaron de ratones con tumores en diferentes grupos y se cocultivaron con células H22 marcadas con eFluor 450 en una proporción de 20:1. 12 horas más tarde, se seleccionaron las células tumorales y se evaluó su apoptosis (gráfico de la derecha). (C) Se calcularon los porcentajes de células tumorales muertas. Cada valor representa la media ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Las comparaciones no marcadas no son estadísticamente significativas.

En ausencia de antígeno coadministrado, el alumbre presumiblemente ejerce su efecto antitumoral al regular positivamente de manera no específica la presentación del antígeno, para activar las células T específicas del antígeno. Sin apuntar a antígenos específicos, es posible que se puedan inducir respuestas inmunes contra una gran cantidad de epítopos derivados de antígenos tumorales, incluidos los normalmente presentes en las células huésped normales. Esto podría conducir a la autoinmunidad. Por otro lado, dado que en nuestro protocolo el alumbre se administró repetidamente, su capacidad para provocar inmunidad innata podría inducir daño tisular no deseado. Las cifras anteriores muestran que el número general de células inmunitarias o los niveles de citoquinas no cambiaron drásticamente en la sangre y el bazo, lo que sugiere la falta de daño sistémico. Se prepararon secciones de bazo, riñón y pulmón siguiendo el ciclo completo de tratamiento con alumbre 5DPI. La tinción con H&E no mostró ninguna diferencia importante entre las muestras de los ratones tratados con PBS y con alumbre (Fig. 6A-C), lo que confirma que el tratamiento repetido con alumbre probablemente sea un protocolo seguro.

Falta de daño general en ratones tratados con alumbre.

A ratones con tumores establecidos se les inyectó ip Al(OH)3 y PBS. Se extirparon el bazo, el hígado y el riñón de los ratones 3 días después del último tratamiento, se seccionaron y se evaluaron mediante tinción con H&E (aumento × 100). (A) Bazo de ratones tratados con PBS o alumbre; (B) Hígado de dos grupos; (C) Riñón de dos grupos.

Utilizado por primera vez en humanos por Glenny en la década de 192046, y extendido a la vacunación poblacional contra la polio por Salk en 195247, el alumbre ha sido el adyuvante más utilizado. La composición detallada del alumbre, ampliamente definida como sal de aluminio trivalente, ha cambiado con el tiempo, desde la potasa de aluminio cruda original hasta los predominantes Al(OH)3 y AlPO4 que se utilizan actualmente. Se ha demostrado que el alumbre es seguro y eficaz para inducir una respuesta de anticuerpos, particularmente IgG1 e IgE48. Sin embargo, su incapacidad para desencadenar respuestas TH1/CTL sigue siendo su principal déficit49. Debido a la apremiante demanda de desarrollar vacunas para combatir tumores y infecciones virales, se han realizado grandes esfuerzos para aumentar su capacidad para inducir presentación cruzada y activación de células T CD8. Por ejemplo, el alumbre se ha mezclado con un lípido A derivado de LPS para aumentar la respuesta contra la malaria50. QS21 basado en saponina también ha demostrado potencial para inducir la activación de las células T CD851. Si bien la mayoría de los adyuvantes TH1/CD8 son demasiado tóxicos para uso humano, aquellos adecuados para la inmunización poblacional todavía están en desarrollo o en uso limitado. Por lo tanto, este informe representa un hallazgo sorprendente de que la inyección de alumbre con un protocolo cuidadosamente diseñado puede inducir una respuesta CTL antitumoral. Es importante señalar que el alumbre, un adyuvante que se ha utilizado de forma segura durante casi un siglo, muestra efectos de supresión de tumores no específicos al desencadenar la respuesta de las células T CD8. Aunque la respuesta fue leve en comparación con otros protocolos y requiere una precisión meticulosa en el momento, sus implicaciones en el desarrollo futuro de la terapia tumoral adyuvante sola son intrigantes.

A pesar de su larga historia, el mecanismo de la adyuvancia del alumbre sigue siendo un tema de debate. En los primeros años, el alumbre se utilizaba para precipitar antígenos microbianos (toxoide). Por tanto, se creía que funcionaba como depósito contra la difusión52. Sin embargo, en ratones deficientes en fibrinógeno, que es esencial para que el alumbre forme estructuras nodulares en el lugar de la inyección, la eficacia del alumbre no cambia53. Además, la extirpación quirúrgica del lugar de la inyección horas después de la inoculación no afecta su adyuvancia54. Por tanto, se descartó la teoría del depósito. En la última década, se ha descubierto que el alumbre estimula los fagocitos (macrófagos y CD) para que secreten IL-1β mediante la activación del inflamasoma NLRP355,56. A esto le siguió un informe que sugería que NLRP3 era fundamental para el efecto adyuvante del alumbre57. Esta noción ha sido cuestionada por múltiples informes de seguimiento en los que no se encontró que la deficiencia de NLRP3/Caspasa-1 reduzca la producción de anticuerpos inducida por alumbre24,58,59,60,61,62,63. Más recientemente, hemos informado que los cristales de alumbre fueron capaces de clasificar las especies de lípidos de la membrana plasmática de DC, principalmente por su fuerte unión a la esfingomielina. Este reordenamiento de lípidos indujo una señalización PI3K dependiente de Syk, lo que llevó a la activación de DC64. Las estructuras cristalinas en los tejidos a menudo provocan la muerte celular y la liberación de contenidos intracelulares. Dos informes sugirieron que la liberación de ADN de las células muertas puede ser capturada por las CD y activar estas células de manera dependiente de MHC II/TLR924,65. Además, también se ha demostrado que el alumbre desencadena la secreción de PGE226,66 en las DC, un conocido factor activador de las DC67,68. Es interesante ya que tanto PI3K como PGE2 son inhibidores de la presentación de antígenos66,69. Nuestro hallazgo de que el alumbre puede desencadenar la activación de las células T CD8+ parece no estar de acuerdo con estos informes. Sin embargo, los ratones tratados con alumbre también producen ácido úrico61,70; el cristal de MSU resultante es un fuerte activador de la presentación cruzada71,72. El grupo de Germain informó hace casi 20 años que la presencia de una diana fagocítica en la superficie de los macrófagos impulsaba a los antígenos externos a la vía de presentación cruzada73,74. Recientemente sugerimos un mecanismo potencial responsable de esta presentación de antígeno redirigido: la unión de objetivos fagocíticos ralentiza la maduración endocítica en las CD. Los antígenos externos que ingresan a la célula a través de esta vía retrasan su procesamiento para la presentación del antígeno MHC de clase II. En cambio, los antígenos se redirigen a la superficie celular en complejo con la molécula MHC de clase I a través de la vía de reciclaje endocítico75.

La sorpresa de este trabajo es la falta de supresión tumoral en esquemas de inyección de alumbre distintos de 5DPI. En nuestros ensayos clínicos anteriores en humanos y en nuestro trabajo en modelos de ratones, informamos que eran necesarias múltiples inyecciones de alumbre para inducir un efecto protector dirigido al HBeAg del VHB o las respuestas inflamatorias, respectivamente76,77. Por lo tanto, la falta de efecto en los otros programas podría reflejar que el alumbre 5DPI capturó una ventana en el establecimiento del tumor permeable a la vigilancia inmune, que desaparecería en momentos posteriores. Sigue siendo difícil determinar exactamente cómo la inyección ip de alumbre resultó en una mejor presentación del antígeno y en el reclutamiento de células T CD8+/neutrófilos en el tumor. Es posible que el alumbre inyectado en un sitio distal pueda promover una mejor conversión de DC inflamatorias de los monocitos circulantes78,79 que luego podrían migrar al sitio de inoculación. Además, el alumbre es un grupo amorfo de cristales, con algunos tamaños en el rango nanométrico, capaces de viajar largas distancias a otros sitios del cuerpo80. Tras la llegada de estas CD o cristales al tumor, se puede establecer un entorno que favorezca la presentación del antígeno, particularmente con la ayuda de citocinas proinflamatorias inducidas simultáneamente81. Sin embargo, la aclaración de estos detalles espera más análisis.

La focalización específica de DC en la vacunación antitumoral tiene su ventaja en potencia. Sin embargo, es importante reconocer que en una respuesta inmune específica de un tumor a gran escala, una fuerte activación de las células T CD8+ depende más que las CD solas. Otros tipos de células, como las CD4+ T, las NK y los neutrófilos, también participan en el resultado final82. Además, las CD se componen de múltiples subtipos y un método de selección de CD determinado probablemente no logre llegar a algunas poblaciones que son potencialmente importantes en las respuestas inmunes tumorales83,84. La inyección de alumbre sola en ratones con tumores es una estrategia pasiva y basada en resultados que pasa por alto la evaluación completa de varios tipos de células y vías de activación. Con su historial de seguridad, esta inmunoterapia tumoral simplista puede conducir a tratamientos adyuvantes adicionales solos para probar su uso potencial en pacientes humanos.

Se adquirieron ratones hembra Balb/c de Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. LTD. Se obtuvieron ratones hembra desnudos (de 5 a 6 semanas de edad) del Instituto de Materia Médica de Shanghai (Academia China de Ciencias, Shanghai, China). Todos los ratones se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en la Universidad de Fudan y se manipularon de acuerdo con las pautas de bienestar animal de la Universidad de Fudan. Hengrui Zhang (Instituto de Hepatología de la Universidad de Pekín, Beijing, China) donó amablemente células de hepatoma H22 de ratón. Las células H22 se cultivaron en medio completo que consistía en RPMI1640, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml y suero bovino fetal (FBS) al 10 %.

Todos los métodos experimentales con ratones fueron aprobados por el Comité de Protocolo Animal de la Universidad de Fudan y se realizaron de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

Anticuerpos monoclonales de rata anti-ratón marcados con fluorescencia: anti-CD3e-FITC (145-2C11), anti-CD4-FITC (GK1.5), anti-CD4-APC (GK1.5), anti-CD8α-PE (53 -6.7), anti-CD11b-FITC (M1/70), controles de isotipo, anticuerpos monoclonales purificados de grado funcional para el agotamiento de neutrófilos, células T CD3+, CD4+, CD8+, incluido el anti-ratón Ly6G (Gr-1) (Rb86-C5) , control de isotipo IgG2b κ de rata (eB149/10H5), CD3e anti-ratón (145-2C11), CD4 anti-ratón (GK1.5), CD8 anti-ratón (53-6.7), tinte de proliferación celular eFluor 670 y proliferación celular El tinte eFluor 450 se adquirió de eBioscience. Anti-ratón-Ly6G-Pacific Blue (1A8) se adquirió de Biolegend.

Se transfirieron células H22 a la cavidad peritoneal de un ratón Balb/c. 7 días después, se recogieron las ascitis y se diluyeron con PBS hasta una concentración de 106 células/ml. Se inyectaron sc un total de 105 células H22 en 0,1 ml en el flanco derecho de ratones Balb/c. Después de 5 días para permitir el establecimiento del tumor, los ratones portadores de tumores se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (5 por grupo): al grupo 1 se le inyectó ip PBS a partir del quinto día; Grupo 2 con Al(OH)3 el mismo día; Grupo 3 con Al(OH)3 a partir del séptimo día; y el Grupo 4 con Al(OH)3 a partir del día 10. Para la inyección de alumbre, a ratones Balb/c (7 por grupo) se les inyectó ip Al(OH)3 (Instituto Nacional de Suero y Vacunas, Beijing, China) a una dosis de 0,25 mg dos veces por semana durante hasta 3 semanas. Las dosis administradas se diluyeron con solución de PBS a 1 mg/ml (250 µl). El crecimiento del tumor se midió usando un calibrador cada 3 días y los tamaños se registraron como el mayor diámetro longitudinal (largo) y el mayor diámetro transversal (ancho). El volumen del tumor se calculó mediante la siguiente ecuación: Volumen = 0,52 × largo × ancho2. Los ratones fueron sacrificados cuando el tumor alcanzó 20 mm de longitud. Para la inoculación de tumores en ratones desnudos, se inocularon sc 105 células H22 por ratón (7 por grupo). Cinco días después, los ratones se dividieron en dos grupos que recibieron Al(OH)3 y PBS como se describió anteriormente.

Se recogieron líquido de lavado peritoneal y líquido intersticial tumoral de ratones 3 días después de la primera, tercera y sexta inyecciones de Al (OH) 3 o PBS. Para el lavado peritoneal, a los ratones se les inyectó ip 1 ml de PBS y se recogió el líquido. Para la adquisición de líquido intersticial tumoral, se recogieron tumores de flanco de ratones Balb/c, se trituraron y se resuspendieron con 1 ml de medio RPMI 1640. Los restos celulares se centrifugaron y los fluidos se pasaron a través de un filtro de jeringa de 0,2 um. En todas las muestras se analizaron IL-1β, IL-10, TNFα, IL-6, CCL2, CXCL9 y CCL5 utilizando el kit de panel magnético de citocinas/quimiocinas de ratón (Milliplex, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Brevemente, a ratones Balb/c se les inyectó ip 100 µg de anti-Ly6G purificado de grado funcional, anti-CD3 de ratón, anti-CD4 de ratón, anti-CD8 de ratón o anticuerpo de isotipo IgG2b κ de rata en 200 µl de PBS. Se inyectó ip una dosis de mantenimiento de 100 μg de anticuerpo dos veces por semana durante todo el período experimental para garantizar el agotamiento.

Se sacrificaron 5 ratones de cada grupo inoculado con tumor 3 días después de la primera, tercera y sexta inyección. Se recogieron bazos y tumores de flanco. El tejido tumoral se picó y se digirió con 4 mg/ml de colagenasa tipo IV y 2 mg/ml de DNasa I (ambas de Sigma) a 37 °C durante 30 min. Se agregaron 5 x 105 células a cada pocillo en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos en un volumen de 100 μl. Se utilizaron CD11b anti-ratón de rata conjugado con FITC y Ly-6G anti-ratón de rata conjugado con Pacific Blue para teñir los neutrófilos; Se utilizaron CD3e, CD8 y CD4 anti-ratón marcados con FITC, PE y APC para teñir células T CD4+/CD8+. Toda la citometría de flujo se realizó en LSR Fortessa (BD). El análisis de los datos se realizó utilizando el software FlowJo.

Se recolectaron LN drenantes de ratones portadores de tumores. Se prepararon suspensiones de células individuales. El tinte de proliferación celular eFluor 670 se disolvió en DMSO como soluciones madre 5 mM. Para el etiquetado con eFluor 670, los linfocitos se resuspendieron a 107 células/ml en PBS y se añadió eFluor 670 5 µM a alícuotas de 1 ml de linfocitos. Las células se incubaron a 20 °C durante 10 min y luego en hielo durante 5 min, se lavaron 3 veces con medio de cultivo. Para el lisado de células H22, se recogieron 3 x 108 células H22 y se resuspendieron en 2 ml de PBS. Se realizaron tres ciclos de congelación-descongelación para obtener lisado celular. Luego las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 min. La concentración de proteína en el sobrenadante se midió mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad) y se diluyó con PBS hasta una concentración final de 10 mg/ml. Se agregaron 3 x 105 linfocitos marcados con eFluor 670 a cada pocillo en placas de 96 pocillos en un volumen de 100 μl y se estimularon con lisado celular H22 (10 μg/ml) a 37 °C en CO2 al 5%. Se utilizaron anti-CD3 (1 µg/ml) y anti-CD28 (0,5 µg/ml) como control positivo. Después de 72 horas de estimulación, se midieron los linfocitos mediante tinción de la superficie celular con mAb CD8 anti-ratón marcado con PE y mAb CD4 anti-ratón marcado con FITC, las células teñidas se analizaron mediante FACS. Los datos se expresaron como índice de estimulación (SI), calculado utilizando la siguiente fórmula: SI = eFluor 670 lisis de células tumorales estimuladas/eFluor 670 no estimuladas.

Se sacrificaron ratones portadores de tumores y se extirparon el bazo, el hígado y el riñón en los momentos indicados. El tejido se colocó en una solución de formalina al 4%. El tejido fijado se cortó longitudinalmente y se incluyó en parafilm. Se realizaron secciones de 4 a 5 μm y luego se tiñeron con H&E. Se utilizó microscopía óptica para identificar el estado de necrosis y condensación del núcleo.

Los tumores de flanco se recogieron 3 días después de la tercera inyección. El procedimiento de enriquecimiento de ARN total y miARN se realizó utilizando el kit de aislamiento de miARN mirVana AM1561 sin fenol (Ambion). El ARN total se cuantificó mediante NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific) y la integridad del ARN se evaluó utilizando Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). El etiquetado de la muestra, la hibridación de microarrays y el lavado se realizaron según los protocolos estándar del fabricante. Brevemente, el ARN total se transcribió en ADNc de doble cadena, luego se sintetizó en ARNc y se marcó con cianina-3-CTP. El ARNc marcado se hibridó en la micromatriz (Agilent Mouse Gene Expression 8*60 K, ID de diseño: 028005). Después del lavado, las matrices fueron escaneadas por el escáner Agilent G2505C. Se utilizó el software Feature Extraction (versión 10.7.1.1, Agilent Technologies) para analizar imágenes de matriz para obtener datos sin procesar. Se empleó Genespring para realizar análisis básicos con los datos sin procesar. En resumen, los datos brutos se normalizaron con el algoritmo cuantil. Las sondas que tienen al menos el 100 % de los valores en cualquiera de todas las condiciones tienen indicadores en "Detectado" y se eligieron para un análisis de datos adicional. Luego se identificaron los genes expresados ​​diferencialmente mediante el cambio de veces y el valor de P calculado con la prueba t. El umbral establecido para los genes regulados hacia arriba y hacia abajo fue un cambio de ≥2,0 y un valor de P ≤0,05. Finalmente, se realizó una agrupación jerárquica para mostrar el patrón de expresión de genes distinguibles entre las muestras.

La sangre completa se recogió mediante punción cardíaca utilizando una jeringa heparinizada. La sangre se diluyó con PBS (1:1) y se sometió a un gradiente discontinuo de Histopaque (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) (1,077 y 1,119). Los neutrófilos se recolectaron de la interfaz 1.077-1.119, los linfocitos y monocitos se recolectaron de la interfaz plasma-1.077. Los glóbulos rojos se eliminaron mediante lisis hipotónica. Las células se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron con medio RPMI 1640 en una concentración final de 106 células/ml. La pureza de los neutrófilos se determinó mediante FACS (>90%).

Las células H22 se marcaron con tinte de proliferación celular eFluor 450. Las células marcadas (5000/pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos en medio RPMI 1640 con FBS al 10 %. Cuatro horas más tarde, se añadieron neutrófilos purificados (105/pocillo) a las células tumorales sembradas en placas y se cultivaron conjuntamente durante la noche. Después de una incubación durante la noche, las células se recogieron para detectar la apoptosis de las células tumorales (células eFluor 450+). La apoptosis se registró utilizando el kit de detección de apoptosis Anexina V-FITC (eBioscience).

El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 6.0 y se presentó como media ± SEM. Se utilizó un análisis de prueba t de Student no apareado para todos los análisis de datos. P <0,05 indica significación estadística.

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Este trabajo fue apoyado en parte por los Proyectos Nacionales de Ciencia y Tecnología de las Principales Enfermedades Infecciosas de China (2008ZX10002-003, 2012ZX10002002004 y 2012ZX10002002) y los Proyectos Nacionales 863 de Alta Tecnología (2012AA02A407). Deseamos agradecer a la Sra. Xu Jing del Instituto Nacional de Sueros y Vacunas, Beijing, China, por proporcionar el Al (OH) 3 para este estudio y a Xiaofei Wang de la Universidad de Tsinghua por la presentación de los datos del chip genético.

Laboratorio clave de virología médica molecular, MOE/MOH, Facultad de Medicina de Shanghai, Universidad de Fudan, Shanghai, China

Bo Wang, Xuanyi Wang, Yumei Wen, Zhangmei Ma y Bin Wang

Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad de Fudan, Shanghai, China

Xingyi Wang

Laboratorio de Cooperación Internacional sobre Transducción de Señales, Instituto/Hospital de Cirugía Hepatobiliar del Este y Centro Nacional de Cáncer de Hígado, Shanghai, China

Jing Fu y Hongyang Wang

Instituto de Inmunología, Departamento de Ciencias Médicas Básicas, Centro de Ciencias de la Vida, Universidad de Tsinghua, Beijing, China

Yan Shi

Departamento de Microbiología, Inmunología y Enfermedades Infecciosas, Universidad de Calgary, Calgary, Canadá

Yan Shi

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BW, XW y JF realizaron todos los experimentos. BW realizó análisis de datos y preparación de figuras. Experimentos diseñados por YW, HW, ZM, YS y BW. YW, YS y BW conceptualizaron el proyecto de investigación. BW y YS escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Los autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Wang, B., Wang, X., Wen, Y. et al. Supresión del hepatocarcinoma establecido con inmunoterapia adyuvante únicamente: el alumbre desencadena una respuesta de células T CD8+ antitumorales. Representante científico 5, 17695 (2015). https://doi.org/10.1038/srep17695

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Recibido: 23 de julio de 2015

Aceptado: 04 de noviembre de 2015

Publicado: 09 de diciembre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep17695

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