La reprogramación metabólica de los macrófagos proinflamatorios mediante el ácido robúrico administrado de manera efectiva mejora los síntomas de la artritis reumatoide

Aug 20, 2023

Transducción de señales y terapia dirigida volumen 8, número de artículo: 280 (2023) Citar este artículo

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La artritis reumatoide (AR) es un trastorno inflamatorio crónico común que generalmente afecta las articulaciones. Se descubrió que el ácido robúrico (RBA), un ingrediente de la hierba anti-AR Gentiana macrophylla Pall., mostraba una fuerte actividad antiinflamatoria. Sin embargo, su aplicación médica está limitada por su hidrofobicidad, falta de capacidad de focalización y mecanismo funcional poco claro. Aquí, construimos un sistema de administración de fármacos de doble objetivo sensible al pH que hacía autostop RBA (RBA-NP) que se dirigía tanto a los receptores CD44 como a los de folato, e investigamos su mecanismo farmacológico. En el modelo de AR en rata, los nanoportadores administraron eficazmente RBA a los sitios inflamatorios y mejoraron significativamente los resultados terapéuticos en comparación con los RBA libres, además de reducir fuertemente los niveles de citoquinas inflamatorias y promover la reparación de tejidos. El análisis posterior reveló que RBA reprogramó los macrófagos M1 en las articulaciones al fenotipo M2. Dado que el equilibrio de los macrófagos pro y antiinflamatorios desempeña un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis inmunitaria y en la prevención de la inflamación excesiva en la AR, es probable que esta reprogramación sea responsable del efecto anti-AR. Además, revelamos que las RBA-NP impulsaron el cambio fenotípico de M1 a M2 al regular negativamente el nivel de glucólisis mediante el bloqueo de la vía ERK/HIF-1α/GLUT1. Por lo tanto, nuestro trabajo no solo desarrolló un sistema de administración dirigido que mejoró notablemente la eficiencia anti-AR de RBA, sino que también identificó un objetivo molecular potencial para reprogramar macrófagos de manera inversa mediante la regulación del metabolismo energético.

La artritis reumatoide (AR) es un trastorno autoinmune crónico común que tiene una progresión patológica compleja marcada por inflamación sinovial y lesión articular.1 Desafortunadamente, a pesar de los recientes avances en terapias inmunodirigidas, ~40% de los pacientes con AR no respondieron al tratamiento con un solo agente. mientras que entre un 5% y un 20% son resistentes a todos los medicamentos actuales.2,3,4,5,6,7,8 Por lo tanto, hay una gran demanda de nuevas dianas moleculares y agentes anti-AR que proporcionen opciones alternativas. Los productos naturales pueden brindar oportunidades para estos desafíos. Se descubrió que el ácido robúrico (RBA) de los extractos de Gentiana macrophylla Pall., una hierba para el tratamiento de la AR en el sudeste asiático, tiene fuertes actividades biológicas como la antiosteoartritis, la antiinflamatoria y la reactivación de afecciones relacionadas con el TNF.9, 10,11,12,13,14,15 Sin embargo, aún no se ha probado en el modelo de AR y su mecanismo funcional no está claro. Aquí, encontramos que la RBA podría mejorar los síntomas de la AR y los efectos parecen estar relacionados con el cambio de las subpoblaciones locales de macrófagos.

Los macrófagos son fagocitos muy diversos que desempeñan importantes funciones inmunitarias.16 En términos generales, los macrófagos ingenuos (M0) pueden polarizarse en los clásicos macrófagos proinflamatorios (M1) o inmunosupresores (M2) después de recibir diferentes estimulaciones.17,18,19 Como era de esperar, hay es un aumento anormal de la proporción M1/M2 durante el desarrollo de la AR.20,21 La reprogramación de los macrófagos M1 a M2 usando terapia génica dirigida con IL-10 podría prevenir la inflamación y el daño articular asociado a la artritis.22 Por lo tanto, manipular el subtipo de macrófagos asociados a las articulaciones tiene un potencial terapéutico considerable y hace más plausible la hipótesis de que RBA reprogramó los macrófagos M1. Por tanto, investigamos cómo RBA reequilibró las subpoblaciones de macrófagos. La polarización y la función de los macrófagos están estrechamente relacionadas con su patrón metabólico.23 Generalmente, los macrófagos M1 utilizan la vía glucolítica para satisfacer sus altas demandas de energía para la respuesta proinflamatoria;24 mientras que los macrófagos M2 dependen predominantemente de la oxidación de ácidos grasos (FAO) y la fosforilación oxidativa ( OXPHOS).25 Durante la progresión de la AR, los macrófagos en las articulaciones inflamadas parecen cambiar a un estado de glucólisis hipermetabólica con proporciones M1/M2 crecientes.26 El uso del inhibidor glucolítico 2-DG o la eliminación de la enzima glucolítica crítica podría reprimir la respuesta proinflamatoria de los macrófagos. 27 Por lo tanto, parece que los macrófagos podrían reprogramarse cambiando su modo metabólico. De hecho, descubrimos que la RBA podría estimular las proteínas quinasas reguladas extracelulares (ERK), que es un miembro de la familia de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) relacionadas con tumores y un activador ascendente del factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α).28 ,29,30 HIF-1α es un componente clave del regulador maestro HIF-1 que responde a la hipoxia, que mejora la expresión de proteínas involucradas en las vías de glucólisis y cambia el modo de producción de energía cuando se activa.31,32,33

Por lo tanto, la eficiencia de RBA podría mejorarse mediante sistemas de administración dirigidos a los macrófagos M1. La focalización de motivos es una estrategia común en el diseño de nanoportadores para mejorar la acumulación de fármacos en sitios específicos. El receptor CD44 y el receptor de folato se sobreexpresan en la superficie de los macrófagos proinflamatorios en la sinovial de la AR.34,35 El ácido hialurónico (HA) y el folato, que son los ligandos naturales de los receptores CD44 y de folato, podrían usarse como objetivo.36, 37,38 Además, la cavidad articular inflamada generalmente tiene un pH más bajo y un sistema de administración sensible al pH puede mejorar aún más la administración de manera eficiente.39 Por lo tanto, generamos un sistema de administración micelar de doble objetivo CD44/folato sensible al pH basado en poli β-amino éster (PAE) para administrar RBA a los macrófagos M1 en la articulación AR (RBA-NP), lo que mejoró significativamente la eficiencia terapéutica de RBA.40

En resumen, construimos una micela autoensamblada basada en un copolímero anfifílico para la administración de RBA (RBA-NP) e investigamos sus efectos terapéuticos y su mecanismo en la terapia de la AR. Las micelas son sensibles al pH y podrían atacar a los macrófagos M1 con un receptor dual activo. Como resultado, las RBA-NP mostraron excelentes efectos terapéuticos en ratas modelo de AR, así como una buena bioseguridad. El estudio mecanicista reveló que la RBA podría bloquear las vías de glucólisis mediadas por HIF-1α, lo que conduce a la reprogramación de los macrófagos M1 a M2, aliviando así la inflamación y remodelando los tejidos de las articulaciones. Este trabajo desarrolló un agente terapéutico eficaz para la AR basado en RBA, descubrió por primera vez el mecanismo funcional de RBA en la terapia de AR y demostró que la vía ERK/HIF-1α/GLUT1 podría ser un objetivo prometedor para el tratamiento de la AR.

El copolímero PAE-HA-FA se sintetizó principalmente mediante polimerización por adición de Michael y reacción de amidato (Figura complementaria 1). PAE-HA-FA apareció como un sólido masivo blanco translúcido con un punto de fusión de 160 ~ 161 °C, un peso molecular de 12000 y un rendimiento del 89%. Las estructuras químicas del copolímero de injerto PAE-HA-FA del producto obtenido se confirmaron mediante FT-IR (Figura complementaria 2), espectroscopia de 1H-NMR y espectroscopia de 13C-NMR (Figura complementaria 3). El copolímero fabricado podría autoensamblarse en nanomicelas para la administración dirigida de RBA (Fig. 1a, b). Se prepararon nanopartículas FA-HA-PAE (RBA-NP) cargadas con RBA y nanopartículas (NP) FA-HA-PAE en blanco mediante el método ultrasónico. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostraron que las NP y RBA-NP en blanco eran aproximadamente esféricas con un tamaño uniforme (Fig. 1c, d). Los tamaños de partículas de las NP en blanco y las RBA-NP fueron de aproximadamente 174,2 nm y 249,4 nm, medidos por DLS (Fig. 1e, f); y los potenciales zeta de las NP en blanco y las RBA-NP fueron −19,9 mV y −17,6 mV, respectivamente (Fig. 1g, h). Además, la concentración micelar crítica (CMC) y la estabilidad sérica analizadas indican que las micelas son generalmente estables en condiciones fisiológicas (Figuras complementarias 4a, b). Los métodos de análisis in vitro FA-HA-PAE y RBA se establecieron en Métodos de respaldo, Tabla complementaria 1-4, Figuras complementarias 5, 6. La pureza de FA-HA-PAE fue del 97,29%, lo que puede usarse para experimentos posteriores. La eficiencia de encapsulación (EE) y la carga de fármaco (DL) de RBA-NP fue de 84,2 ± 1,3% y 9,6 ± 0,8%, respectivamente.

Preparación y caracterización de NPs en blanco y RBA-NPs. una ilustración esquemática de la preparación y el mecanismo terapéutico de RBA-NP contra la AR. b La estructura química y el peso molecular de RBA. Las imágenes TEM c, d mostraron que las NP en blanco y las RBA-NP eran aproximadamente esféricas con un tamaño uniforme. e, f Los tamaños de partículas de las NP en blanco y las RBA-NP fueron de aproximadamente 174,2 nm y 249,4 nm, medidos por DLS. g, h Los potenciales zeta de las NP en blanco y las RBA-NP fueron −19,9 mV y −17,6 mV, respectivamente. i La liberación in vitro de RBA de RBA-NP en diferentes condiciones (pH = 5,0, 6,8 o 7,4) en 72 h. j Estabilidad de RBA-NP en diferentes condiciones (pH = 5,0, 6,8 o 7,4) en 24 h

Debido a que el núcleo de PAE está diseñado para degradarse a pH bajo, examinamos las tasas de liberación acumuladas de RBA de micelas poliméricas y el tamaño de partícula de micelas en blanco en diferentes condiciones de pH in vitro. Se utilizó tampón PBS a pH 7,4, 6,8 y 5,0 para imitar la condición fisiológica normal, el microambiente de las articulaciones de la AR y la situación del citolisosoma, respectivamente.41 Como se muestra en la Fig. 1i, a pH 7,4, las RBA-NP eran relativamente estables y las tasas de liberación de RBA fueron lentas (~14% de RBA liberado a las 24 h y ~17% a las 72 h) sin una liberación aparente de ráfaga. En comparación, a pH 6,8, se liberó ~50 % de RBA a las 24 h y ~59 % a las 72 h, y la fuga de RBA se aceleró aún más a pH 5,0, alcanzando ~71 % a las 24 h y ~82 % a las 72 h. . Consistentemente, las nanomicelas se mantuvieron estables después de 24 h de incubación a pH 7,4, y el tamaño de las micelas aumentó significativamente a pH 6,8 y 5,0 (Fig. 1j). Por lo tanto, las nanomicelas cargadas de RBA se generaron con éxito con una sensibilidad de pH designada.

A continuación se examinó la capacidad de orientación de los nanoportadores fabricados. En este caso, se utilizó 1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindodicarbocianina (DiD) como marcador en lugar de RBA (DiD-NP), para marcar la absorción de nanomicelas en las células y la fluorescencia. localización en animales.42 En primer lugar, se evaluaron las captaciones celulares de DiD y DiD-NP libres mediante CLSM y citometría de flujo en células RAW264.7 RAW264.7 y LPS + IFN-γ activadas in vitro. Los resultados del CLSM mostraron que los DiD-NP disfrutaron de una absorción celular significativamente mejor en comparación con el DiD libre (Fig. 2a, b). El análisis de citometría de flujo mostró que la intensidad de fluorescencia de DiD-NP en células RAW264.7 activadas con LPS + IFN-γ era aproximadamente 4,98 veces mayor que la de DiD libre, y 1,33 veces en RAW264.7 (Fig. 2c y Fig. 7 complementaria). ). Luego se verificó la dependencia de CD44 y del receptor de folato de las NP fabricadas. La expresión de CD44 y receptores de folato aumentó significativamente en la superficie de las células RAW264.7 activadas con LPS + IFN-γ (Fig. 2d). Cuando las células RAW264.7 activadas con LPS + IFN-γ se trataron previamente con HA o FA libres para competir por los receptores CD44 o de folato sobreexpresados, la absorción de DiD-NP se redujo al 51,8% y 65,1% de las células no tratadas, respectivamente; y cuando se agregaron HA y FA, ​​el nivel de señal cayó al 24,5% (Fig. 2e). Las micrografías confocales muestran que las DiD-NP se colocalizaban con el receptor CD44 y el receptor de folato, lo que indica que las DiD-NP podrían apuntar a receptores duales en la superficie de los macrófagos proinflamatorios (Fig. 2f).

Los RBA-NP muestran capacidad de focalización in vitro. a, b Las micrografías confocales mostraron que las DiD-NP (rojas) disfrutaron de una absorción celular significativamente mejorada en comparación con la DiD libre en células RAW264.7 activadas con LPS + IFN-γ. Barra de escala = 10 μm. c El análisis de citometría de flujo mostró que la intensidad de fluorescencia de DiD-NP en células RAW264.7 activadas con LPS + IFN-γ era mayor que la de DiD libre en RAW264.7. d La expresión de CD44 y receptores de folato aumentó significativamente en la superficie de las células RAW264.7 activadas con LPS + IFN-γ (d). Barra de escala = 10 μm. Los macrófagos activados con LPS + IFN-γ se trataron previamente con HA o FA o tanto HA como FA para competir por los receptores CD44 o de folato sobreexpresados, y se redujo la captación celular de DiD-NP. f Las micrografías confocales mostraron colocalización de DiD-NP (naranja) con el receptor CD44 (rojo) y el receptor de folato (verde). Barra de escala = 20 μm. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). Todos los resultados se muestran como media ± DE. *P<0,05. La dosis de LPS e IFN-γ fue de 100 ng/mL y 20 ng/mL

Luego, se investigó la biodistribución de NP en un modelo de rata con artritis inducida por adyuvante (AIA) que se estableció mediante inyección subcutánea con CFA en la base de las colas de rata. Luego, a las ratas modeladas se les inyectó por vía intravenosa DiD o DiD-NP libres a través de la vena de la cola. Las articulaciones artríticas fueron seccionadas y teñidas mediante métodos de inmunofluorescencia. Nuevamente, se puede ver que el receptor CD44 y el receptor de folato se sobreexpresaron en macrófagos inflamatorios (como lo marca CD68) en articulaciones inflamadas (Fig. 3a). De acuerdo con los datos in vitro, la fluorescencia de DiD en la articulación sinovial del grupo tratado con DiD-NP es mayor que la del grupo DiD libre (Fig. 3b, c). Además, la señal DiD del grupo DiD-NP se superpone principalmente con el receptor CD44 y el receptor de folato, mientras que el grupo DiD libre mostró niveles bajos de colocalización del receptor CD44 y el receptor de folato. En consecuencia, las intensidades de fluorescencia de DiD en las articulaciones a las 0,5, 2, 6, 12, 24 y 48 h después de la administración se midieron utilizando un sistema de imágenes in vivo (Fig. 3d y Fig. Suplementaria 8a). La señal de fluorescencia fue insignificante en las articulaciones inflamadas de ratas AIA tratadas con DiD libre, mientras que se observaron señales de fluorescencia intensas en las articulaciones artríticas ya a las 0,5 h en los grupos de NP. El grupo DiD-NP mostró una mayor intensidad de fluorescencia en cada momento y la fluorescencia persistió hasta 48 h. La distribución de las DiD-NP en el corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y articulaciones de ratas AIA también se evaluó a las 6, 12 y 24 h después de la administración (Fig. 3e y Fig. Suplementaria 8b). Está claro que las intensidades de fluorescencia fueron más fuertes en las articulaciones inflamadas que en el corazón, los pulmones y los riñones. El alto nivel de fluorescencia en el bazo puede estar relacionado con el hecho de que el bazo es un órgano inmunológico importante. Estos resultados en conjunto muestran que las NP de doble objetivo fabricadas podrían entregar de manera eficiente y selectiva cargas cargadas a macrófagos proinflamatorios y lograr una acumulación notablemente mejorada en las articulaciones inflamadas de ratas AIA.

Los RBA-NP muestran capacidad de orientación in vivo. a Las micrografías confocales mostraron los niveles de expresión del receptor CD44 (verde) y del receptor de folato (verde) en macrófagos en las articulaciones inflamadas de ratas AIA. Los macrófagos estaban marcados con el anticuerpo CD68 (rojo). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. b, c Las micrografías confocales mostraron la colocalización de DiD y DiD-NP libres con el receptor CD44 y el receptor de folato en las articulaciones inflamadas de ratas AIA. Los DiD y DiD-NP gratuitos estaban coloreados en rojo. El receptor CD44 y el receptor de folato estaban coloreados en verde. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. n = 5 animales independientes. d La imagen de la fluorescencia de DiD en las articulaciones después de la administración intravenosa de DiD o DiD-NP libres en diferentes momentos después de la administración. n = 5 animales independientes. El grupo DiD-NP mostró una mayor intensidad de fluorescencia en cada momento y la fluorescencia persistió hasta 48 h. e La distribución de DiD-NP en corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y articulaciones en ratas AIA se evaluó a las 6, 12 y 24 h después de la administración. n = 5 animales independientes. Las intensidades de fluorescencia fueron más fuertes en las articulaciones inflamadas.

A continuación, se evaluó la eficacia terapéutica del tratamiento con RBA-NP en ratas AIA (Fig. 4a). En esta parte, se seleccionó un fármaco glucocorticoide, dexametasona (Dex), como grupo de control positivo del fármaco. Actualmente, Dex es un fármaco común para aliviar los síntomas de los pacientes con AR debido a sus poderosos efectos antiinflamatorios y analgésicos. El esquema de administración del grupo Dex fue el mismo que el del grupo RBA-NP. Después de 14 días de inducción de la artritis, los tobillos y las patas de las ratas AIA mostraron una hinchazón grave. Se inyectaron por vía intravenosa solución salina o RBA-NP a ratas (5 mg/kg de RBA). Como se ilustra en las figuras 4b, f y g, RBA-NP y Dex mostraron una fuerte eficacia terapéutica, aliviando significativamente el desarrollo de la enfermedad y reduciendo la hinchazón de las patas después de la administración. Por el contrario, el grosor de la pata y la puntuación de artritis de las ratas AIA en el grupo de NP en blanco apenas difirieron con el grupo AIA, mientras que la RBA libre sólo pudo reducir ligeramente la hinchazón de la pata y la puntuación de artritis. Para evaluar más a fondo la inflamación de las articulaciones y los niveles de destrucción del cartílago, se realizó un análisis histológico de cortes de las articulaciones del tobillo de ratas. Las secciones teñidas con H&E en el grupo AIA y NP en blanco mostraron una gran cantidad de infiltración de células inflamatorias e hiperplasia sinovial grave. En comparación con el grupo AIA, el grupo RBA libre tuvo un efecto limitado en el alivio de estos síntomas, mientras que RBA-NP y Dex redujeron fuertemente la inflamación sinovial (Fig. 4c). La tinción con Safranin-O Fast-Green reveló que la mayor parte del cartílago y los tejidos óseos desaparecieron en algunas secciones de las articulaciones en el grupo AIA y NP en blanco. En marcado contraste, se pudo encontrar cartílago intacto y teñido de rojo en las articulaciones de los grupos RBA-NP y Dex, lo que demuestra que los RBA-NP disminuyeron efectivamente la lesión del cartílago articular (Fig. 4d). Inmunológicamente, los índices de bazo y timo aumentaron significativamente en el grupo de AIA en comparación con las ratas normales, que se redujeron notablemente en el grupo tratado con RBA-NP y Dex hasta casi el nivel de control (Fig. 4h, i). Los ensayos inmunohistoquímicos revelaron que las RBA-NP regulaban efectivamente la secreción de citocinas inflamatorias como IL-1β (Fig. 4e), IL-6 (Fig. 9 complementaria) y TNF-α (Fig. 9 complementaria) en las articulaciones del tobillo. .

Las RBA-NP inhiben la inflamación y promueven la reparación de la erosión ósea en ratas AIA. a La ilustración esquemática del tratamiento de RBA-NP. b Fotografías representativas de las extremidades traseras al final del experimento de diferentes grupos de tratamiento. Barra de escala = 10 mm. c La evaluación histopatológica de las articulaciones del tobillo se identificó mediante H&E. Barra de escala = 100 μm. d Detección de lesión del cartílago de la articulación del tobillo de ratas en cada grupo mediante tinción verde con Safranin O-Fast (n = 5 animales independientes). Barra de escala = 100 μm. e Análisis inmunohistoquímicos de los niveles de expresión de IL-1β en articulaciones artríticas en diferentes grupos (n = 5 animales independientes). Barra de escala = 80 μm. Los niveles de expresión de IL-6 y TNF-α en articulaciones artríticas se mostraron en la figura complementaria 8. f, g El grosor de la pata y la puntuación de artritis de ratas AIA se registraron cada dos días durante el período de tratamiento. Los datos representan la media ± DE (n = 7 animales independientes). *P < 0,05 frente al grupo NS. h, i El índice de bazo y timo de ratas AIA se registró cada dos días durante el período de tratamiento. Los datos representan la media ± DE (n = 7 animales independientes). #P < 0,05 frente al grupo normal; *P < 0,05 frente al grupo NS. j Detección de niveles de expresión de osteoclastos teñidos con TRAP y osteoblastos teñidos con ALP en articulaciones artríticas en diferentes grupos (n = 5 animales independientes). Barra de escala = 100 μm. Los osteoclastos ubicados en la cavidad medular se tiñeron de rojo. Las células multinucleares TRAP positivas que contenían más de tres núcleos se denominaron osteoclastos. k Relación RANKL/OPG en articulaciones artríticas de ratas que recibieron el tratamiento indicado. Los datos representan la media ± DE (n = 5 animales independientes). l Imágenes de micro-CT representativas de las articulaciones anterolateral y posterolateral del tobillo al final del experimento de diferentes grupos de tratamiento en el estudio de eficacia terapéutica (n = 6). Barra de escala = 2 mm. m – q Análisis cuantitativo por micro-CT de las puntuaciones del cartílago articular, DMO, BS/BV, Tb.Sp y Tb.Th de las articulaciones del tobillo en el punto final del experimento. Los datos representan la media ± DE (n = 3 animales independientes)

Para comprobar si las RBA-NP podrían restaurar la función ósea y promover la reparación de tejidos, evaluamos los efectos de las RBA-NP en los niveles de expresión de marcadores relacionados mediante inmunohistoquímica de osteoclastos teñidos con fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) y fosfatasa alcalina (ALP). osteoblastos teñidos en articulaciones artríticas (Fig. 4j). Los osteoclastos ubicados en la cavidad de la médula se tiñeron de rojo cuando se utilizó el ensayo de tinción TRAP, y las células multinucleares positivas para TRAP que contenían más de tres núcleos se denominaron osteoclastos. Los resultados mostraron que las ratas del grupo AIA sufrieron osteoclastos intensos y erosión ósea en las articulaciones del tobillo, mientras que RBA-NP y Dex redujeron el número de osteoclastos y promovieron la reparación del daño óseo, con una expresión de ALP significativamente mayor (se usaron flechas para marcar los lugares donde se producían los osteoblastos). . Experimentos adicionales mostraron que las RBA-NP y Dex redujeron los niveles de expresión del activador del receptor del ligando del factor nuclear κB (RANKL) y el nivel de osteoprotegerina (OPG) regulado al alza en las articulaciones artríticas de ratas, lo que llevó a una relación RANKL/OPG reducida (Fig. 4k y figura complementaria 10).

Luego, la erosión ósea se verificó aún más de una manera más visualizada mediante análisis micro-CT (Fig. 4l). Las imágenes superior e inferior representaban las articulaciones anterolateral y posterolateral del tobillo en la misma rata. Se utilizaron flechas para marcar los lugares donde se produjo el daño al tejido óseo. Los grupos de AIA y NP en blanco mostraron una superficie ósea rugosa y una erosión ósea severa en el tobillo inflamado el día 28 después del tratamiento. También hubo una reducción significativa en la densidad mineral ósea (DMO), un aumento en las puntuaciones del cartílago articular y BS/BV en estos dos grupos en comparación con las ratas normales. Si bien el RBA libre solo proporcionó un alivio moderado de la erosión ósea, el tratamiento con RBA-NP y Dex dio como resultado una superficie ósea lisa y una DMO alta cercana a la de las ratas normales (Fig. 4m-o). Como era de esperar, el tratamiento con RBA-NP y Dex mostró los efectos más destacados en la reducción de la separación trabecular (Tb.Sp) y el aumento del espesor del hueso trabecular (Tb.Th) (Fig. 4p, q). Todos estos datos respaldan que las RBA-NP podrían suprimir eficazmente la progresión de la lesión del cartílago y promover la reparación de la erosión ósea en ratas AIA.

Como se informó, reequilibrar la relación M1/M2 inadecuada en las articulaciones de la AR podría mitigar el daño articular, ya que M1 parece ser capaz de impulsar el proceso patológico de la AR.43 Dado que los macrófagos M1 internalizaron eficientemente las RBA-NP e inhibieron significativamente la inflamación y el daño tisular, es necesario explorar su papel en la polarización M1/M2.

Para comprobar esta posibilidad, se utilizaron líneas celulares de macrófagos humanos y de ratón RAW264.7 y células THP-1. Estas células fueron pretratadas con LPS + IFN-γ o IL-4 + IL-13 para inducir la polarización del fenotipo M1 o M2. Luego, estas células se analizaron mediante tinción de inmunofluorescencia de CD68 y F4/80 (los marcadores panmacrófagos), CD86 (marcador M1) y CD206 (marcador M2). Como se esperaba, se encontró un aumento notable en CD86 en RAW264.7 pretratado con LPS e IFN-γ. Después del tratamiento con RBA-NP, la intensidad de fluorescencia de CD86 disminuyó mientras que la intensidad de fluorescencia de CD206 aumentó, lo que sugiere que los macrófagos posiblemente se repolarizaron de macrófagos M1 a M2 (Fig. 5a y Figs. Suplementarias 11-13). Por otro lado, no hay cambios notables en los macrófagos M2 después del tratamiento con RBA-NP. Las células THP-1 dieron resultados similares (Fig. 5a y Fig. 14 complementaria). Por lo tanto, estos datos sugirieron que los RBA-NP promovieron efectivamente la repolarización de macrófagos de M1 a M2 en macrófagos tanto de ratón como de humanos.

Los RBA-NP reprograman macrófagos M1 proinflamatorios en macrófagos M2 antiinflamatorios en células RAW264.7 y THP-1. Se pretrataron células RAW264.7 y THP-1 con LPS + IFN-γ o IL-4 + IL-13 para inducir la polarización del fenotipo M1 o M2. Tinción de inmunofluorescencia de CD68 (rojo, marcadores panmacrófagos), CD86 (marcador M1, verde) o CD206 (marcador M2, verde) y núcleos (azul) en macrófagos de fenotipo M1 sin o con tratamiento RBA-NP. Barra de escala = 20 μm. b Las proporciones de macrófagos de fenotipo M1 (CD86+) y macrófagos de fenotipo M2 (CD206+) sin o con tratamiento RBA-NP se detectaron mediante ensayo de citometría de flujo en células RAW264.7 y THP-1. c Las expresiones de los genes productores de macrófagos del fenotipo M1 (iNOS, TNF-α, IL-1β) y del fenotipo M2 (Arg-1, IL-10, TGF-β) se detectaron en células RAW264.7 y THP-1. Los datos se expresaron como media ± DE, n = 5. #P < 0,05 frente al grupo normal; *P < 0,05 frente al grupo M1

Además, esta hipótesis también se verificó mediante citometría de flujo utilizando células RAW264.7 y THP-1 (Fig. 5b, Fig. Suplementaria 15, 16). La proporción de macrófagos M1 y M2 cambió del 38,9% y 0,076% al 29,7% y 18,4% en las células RAW264.7 después del tratamiento con RBA-NP, respectivamente. En las células THP-1, la proporción cambió del 53,5% y 0,32% al 25,8% y 30,9%, respectivamente. Finalmente, las RBA-NP suprimieron de manera destacada los niveles de expresión de marcadores M1, incluidos iNOS, TNF-α, IL-1β, y niveles elevados de marcadores M2, incluidos Arg-1, IL-10 y TGF-β (Fig. 5c) en ambas células. líneas. En conjunto, llegamos a la conclusión de que las RBA-NP causaron la transición fenotípica de macrófagos de M1 a M2.

Luego exploramos los mecanismos de reprogramación de macrófagos por RBA-NP utilizando métodos proteómicos. En total, se identificaron 4068 proteínas en macrófagos analizados (Figura complementaria 17a). En comparación con el control, el tratamiento con RBA-NP cambió significativamente los niveles de expresión de 235 proteínas, de las cuales 106 estaban reguladas al alza y 129 a la baja (Fig. 6a, Fig. 17b complementaria, Materiales complementarios 1). Las funciones de estas proteínas que afectan significativamente se anotaron utilizando el análisis de enriquecimiento de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Los resultados del análisis GO indicaron que estas proteínas estaban involucradas principalmente en el proceso metabólico, el proceso del sistema inmunológico, la respuesta inmune innata y adaptativa, la respuesta inflamatoria y la actividad catalítica (Figuras complementarias 18a-c, Figuras complementarias 19a-d). No es sorprendente que estuvieran involucradas proteínas inmunes e inflamatorias, pero la gran cantidad de proteínas relacionadas con el metabolismo identificadas fue inesperada. Por lo tanto, las vías metabolómicas relacionadas de estas proteínas se analizaron más a fondo mediante enriquecimiento con KEGG (Fig. 6b). Se puede ver que las proteínas afectadas por el tratamiento con RBA-NP se enriquecen en el metabolismo de los ácidos grasos, la glucólisis y otras vías. Por lo tanto, el tratamiento con RBA-NP pareció ajustar el metabolismo energético y el sistema inmunológico en los niveles de traducción de proteínas. Tal como se presentó, el microambiente inmunológico de la AR promovió la reprogramación metabólica desde la FAO hasta la glucólisis en los macrófagos.26 Curiosamente, los modos metabólicos característicos de los macrófagos M1 y M2 fueron consistentes con los resultados de la proteómica. Luego utilizamos la base de datos STRING para construir redes de interacción proteína-proteína (PPI) para analizar las relaciones funcionales de las proteínas metabólicas relativas (Figura complementaria 20 y Materiales complementarios 2). Las redes PPI muestran nuevamente que las proteínas más concentradas en los nodos fueron las involucradas en tres procesos metabólicos importantes: glucólisis, FAO y OXPHOS, donde la glucólisis a menudo se considera un patrón metabólico importante.

Las RBA-NP impulsan el cambio fenotípico de M1 a M2 al regular negativamente el nivel de glucólisis mediante el bloqueo de la vía ERK/HIF-1α/GLUT1. Un gráfico de volcán de todas las proteínas identificadas en este estudio. Los puntos rojos y azules indican proteínas reguladas hacia arriba o hacia abajo de manera significativa, respectivamente (cambio de veces de> 1,5 o <0,667 y valor de p de <0,05). b Vías significativamente modificadas de los genes regulados positivamente expresados ​​diferencialmente según el análisis KEGG. Las proteínas afectadas por el tratamiento con RBA-NP se enriquecieron en el metabolismo de los ácidos grasos, la glucólisis y otras vías. c – e El histograma de ECAR, ATP relativo y niveles de lactato en diferentes grupos. La producción de ECAR, ATP relativo y lactato podría reflejar la capacidad de glucólisis. Los datos representan la media ± DE (n = 5). *P < 0,05 frente al grupo M0; #P <0,05 frente al grupo M1. Los kits analizaron los niveles f – h de IL-1β, TNF-α e IL-6. Los datos representan la media ± DE (n = 5). *P < 0,05 frente al grupo M0; #P <0,05 frente al grupo M1. i Tinción de inmunofluorescencia de LDHA (verde) y núcleos (azul) en macrófagos M1 en diferentes grupos. Barra de escala = 20 μm. LDHA fue el último paso en el proceso de glucólisis catalítica y un indicador importante para medir el proceso de glucólisis. j Tinción de inmunofluorescencia de ERK (rojo), HIF-1α (verde), GLUT1 (rojo) y núcleos (azul) en macrófagos M1 en diferentes grupos. Barra de escala = 20 μm. Las RBA-NP bloquearon significativamente la vía ERK/HIF-1α/GLUT1. k Las proporciones de macrófagos de fenotipo M1 (CD86+) y macrófagos de fenotipo M2 (CD206+) en macrófagos M1 en diferentes grupos sin o con tratamiento siERK se detectaron mediante ensayo de citometría de flujo. l Se detectaron las expresiones de los genes productores de macrófagos del fenotipo M1 (iNOS, TNF-α, IL-1β) y del fenotipo M2 (Arg-1, IL-10, TGF-β). Los datos se expresaron como media ± DE, n = 4. #P < 0,05 frente al grupo normal; *P < 0,05 frente al grupo M1

Por lo tanto, se examinó la capacidad glucolítica en los macrófagos M1 para verificar la regulación del metabolismo energético intracelular por parte de las RBA-NP. La tasa de acidificación extracelular (ECAR) es un indicador de la actividad de la glucólisis.44 Los resultados muestran que la ECAR en los macrófagos M1 fue 2,5 veces mayor que la de las células normales (Fig. 6c). Después del tratamiento con 20 o 40 μM de RBA-NP, la ECAR de los macrófagos M1 casi volvió a la normalidad. La eficiencia de la producción de ATP es otro indicador de la glucólisis, ya que la eficiencia de la producción de ATP de la glucólisis es mucho menor que la de la FAO.45 Como se muestra en la Fig. 6d, la baja producción de ATP de los macrófagos M1 podría aumentar mediante el tratamiento con RBA-NP, donde una dosis más alta proporcionó efecto más fuerte. Las RBA-NP también disminuyeron la producción de lactato de una manera dependiente de la dosis, que es un producto importante durante la glucólisis (Fig. 6e). Al mismo tiempo, las RBA-NP suprimieron el alto nivel de lactato deshidrogenasa A (LDHA) (Fig. 6i), que desempeña un papel clave en el último paso de la glucólisis catalítica, en los macrófagos M1.46 Además, las RBA-NP inhibieron la Expresiones de IL-1β, IL-6 y TNF-α en macrófagos M1 (Fig. 6f – h). Todos estos datos sugieren que las RBA-NP regulan negativamente el nivel de glucólisis en los macrófagos M1, y la dosis más alta conduce a un efecto más fuerte.

En el estado inflamatorio, HIF-1α podría mejorar la síntesis de lactato y regular positivamente genes diana como LDHA y GLUT1, y la expresión elevada de HIF-1α es una característica clave de la glucólisis de los macrófagos M1.47 En las primeras investigaciones, encontramos que el aumento de la expresión de HIF-1α fue notablemente suprimido por RBA-NP en macrófagos M1 y el inhibidor de HIF-1α PX-478 mostró redundancia funcional con RBA-NP (Figs. complementarias 21-23). Luego exploramos más a fondo cómo actúa RBA en relación con las vías relacionadas con HIF-1α.

Primero, recolectamos las muestras de macrófagos M1 de ratón tratados y no tratados con RBA-NP y las procesamos para análisis proteómicos. El enriquecimiento de KEGG basado en datos proteómicos muestra que cuatro tipos de proteínas en la vía de señalización HIF-1 (ko04066) cambian significativamente: transportador de glucosa 1 (GLUT1), proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK), dominio tipo FR de unión a FAD que contiene proteína (Cyb) y factor de iniciación eucariota 4E2 (EIF4E2) (más detalles en la Tabla complementaria 5). GLUT1, que estuvo involucrado en procesos como el metabolismo de la glucosa y la respuesta inmune,48 experimentó el mayor cambio (valor de p: 5,65231E-06). Más específicamente, GLUT1 funciona aguas abajo de HIF-1α y acelera el transporte de glucosa para soportar los altos niveles de glucólisis en los macrófagos proinflamatorios.49 Las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) fueron las segundas más afectadas (valor p: 2.04611E-05 ). Como miembro importante de la familia MAPK, ERK es capaz de regular la expresión de HIF-1α.50 Por lo tanto, parece que la vía ERK/HIF-1α/GLUT1 se ve fuertemente afectada por las RBA-NP.

En los siguientes experimentos, se investigaron más a fondo ERK y GLUT1. En comparación con los macrófagos estáticos, el contenido de proteína ERK, HIF-1α y GLUT1 en los macrófagos M1 aumentó (Fig. 6j y Fig. 24 complementaria). El tratamiento con RBA-NP 20 μM restringió el nivel de estas proteínas, y RBA-NP 40 μM dio como resultado efectos más fuertes, lo que indica que la represión de RBA-NP en ERK, HIF-1α y GLUT1 dependía de la concentración. Luego, se usó ARNip de ERK para derribar ERK (Fig. 6j). Bajo esta condición, las RBA-NP no afectaron la expresión de HIF-1α y GLUT1, lo que es consistente con el modelo de señalización actual de que ERK está aguas arriba de HIF-1α y GLUT1.

Un análisis adicional de citometría de flujo también mostró que las RBA-NP básicamente no tuvieron ningún efecto en la proporción M1/M2 después de la eliminación de ERK, ya que el agotamiento de ERK aumentó significativamente la porción de macrófagos M2 hasta un 68,8% por sí solo (Fig. 6k y Suplementario). Figura 25). Por el contrario, sin el tratamiento con siERK, los RBA-NP redujeron nuevamente la porción de macrófagos positivos para CD68 y elevaron el número de macrófagos positivos para CD206. Además, el ensayo de expresión de marcadores M1, incluidos iNOS, TNF-α, IL-1β y marcadores M2, incluidos Arg-1, IL-10, TGF-β, también dio resultados consistentes (Fig. 6i).

Por lo tanto, todas estas evidencias respaldan que las RBA-NP posiblemente reprogramaron la polarización de los macrófagos mediante el bloqueo de la vía ERK/HIF-1α/GLUT1.

También se evaluó brevemente la bioseguridad de las RBA-NP tanto in vitro como in vivo. Inicialmente, la citotoxicidad de las NP se evaluó utilizando células RAW264.7 y THP-1 in vitro. Las células fueron expuestas a NP en diferentes concentraciones durante 24 h. Los resultados revelaron que la viabilidad celular todavía estaba por encima del 90% a una concentración de hasta 40 μg/ml en ambas células (Figuras complementarias 26, 27). La citotoxicidad de RBA y RBA-NP libres dependió de la dosis, y la tasa de supervivencia celular se redujo del 80% con una dosis de 40 μM al 50%. a 100 μM (Figs. complementarias 28, 29). Los resultados indican que RBA fue el principal factor que afectó la actividad celular, mientras que el vehículo de administración no afectó la actividad celular dentro del rango de concentración bajo investigación.

Luego, las ratas sanas fueron tratadas con diferentes dosis de RBA-NP, y se tomaron muestras de sangre, orina y órganos importantes de estas ratas después de un período de tiempo predeterminado y se examinaron. Indicadores de función hepática alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) (Figuras complementarias 30a, b); indicadores de función cardíaca creatina quinasa (CK) y deshidrogenasa láctica (LDH) (Fig. complementaria 30c, d); indicadores de función renal creatinina (CREA) y ácido úrico (UA) (Figura complementaria 30e, f); indicadores de la función del bazo, glóbulos blancos (WBC), glóbulos rojos (RBC) y plaquetas (PLT) (Figura complementaria 30g-i); indicador de edema de tejido pulmonar relación de peso W/D del pulmón (Figura complementaria 30j); y se midieron el peso corporal de la rata (Figura complementaria 30k). Estos indicadores no cambian significativamente después del tratamiento con RBA-NP.

Finalmente, se seccionaron muestras de corazones, hígados, bazos, pulmones y riñones y se tiñeron con H&E (Figura complementaria 31). Las imágenes mostraron que las RBA-NP no indujeron una necrosis o inflamación clara en estos órganos. Por tanto, las RBA-NP parecen ser biocompatibles y no causan daños agudos a los órganos principales.

El cambio de fenotipo de macrófagos M1-M2 es el tema central de este estudio. Descubrimos inesperadamente que la alternancia de la vía metabólica de los macrófagos M1 parecía regular de manera inversa su polarización (Fig. 5), ya que a menudo se supone que la polarización es la causa del cambio metabólico y la posterior alternancia funcional (p. ej., liberación de citoquinas inflamatorias).45,46 Hasta donde sabemos, solo hay dos informes recientes que brindan evidencia de dicha reprogramación de M1 a M2 impulsada por el metabolismo.47,48 Sin embargo, hay literatura que respalda este mecanismo de repolarización de alguna manera. Primero, la glucólisis robusta en los macrófagos mantiene la transcripción de factores inflamatorios y ayuda a la polarización del fenotipo M1, y la inhibición de la glucólisis podría afectar sus funciones típicas, incluida la fagocitosis, la secreción de citoquinas proinflamatorias y la producción de ROS.49,50,51 Segundo, macrófagos M2 la polarización en el tumor también está fuertemente influenciada por la glutaminolisis y otros factores metabólicos relacionados.52,53,54

En general, las vías de señalización de la regulación de la glucólisis parecen estar fuertemente relacionadas con el fenotipo de los macrófagos. La vía HIF-1α relacionada con la hipoxia parece desempeñar un papel central en el aumento de la polarización M1 en la AR. En la articulación afectada por AR, el cambio metabólico de FAO y OXPHOS a la glucólisis en los macrófagos permite que se produzca energía independientemente del suministro de oxígeno.55 HIF-1α se une a HIF-1β para formar HIF-1 después de la translocación del núcleo en condiciones hipóxicas.47 HIF- 1 luego se une a los elementos que responden a la hipoxia y mejora la transcripción de IL-1β y genes implicados en las vías de glucólisis, como GLUT1.33 Como transportador de glucosa, GLUT1 regula positivamente las tasas glucolíticas y reduce la capacidad respiratoria.56 Por ejemplo, la gota y los cristales relacionados con la pseudogota condujeron a un recableado metabólico hacia la vía de la glucólisis aeróbica mediante un aumento en la expresión de GLUT1 y la absorción de glucosa en los macrófagos.57 Además, las 12 enzimas necesarias para la glucólisis (como LDHA, HK2 y PFK1) también son regulado por HIF-1α.58 En modelo animal, el tratamiento combinado con LPS e IFNγ también pareció estabilizar HIF-1α e inducir la reprogramación metabólica para la glucólisis en macrófagos M1.59

Curiosamente, encontramos que la actividad reducida de ERK puede haber iniciado la disminución de HIF-1α en los macrófagos M1 después del tratamiento con RBA (Fig. 6). Se sabe que ERK es parte de la cascada de quinasas RAS/RAF/MEK/ERK.50,60 La ERK activada no solo aumenta la traducción de HIF-1α sino que también puede mejorar su activación transcripcional.30 La eliminación de ERK mostró un efecto muy similar en M1 macrófagos como tratamiento con RBA-NP, ERK podría ser potencialmente un objetivo farmacológico valioso para el tratamiento de la AR que comparte el mecanismo terapéutico con RBA. Aunque hubo informes anteriores que identificaron a los inhibidores de ERK como posibles fármacos para la AR y se sabe que ERK desempeña un papel en la reprogramación metabólica en el cáncer, somos los primeros en encontrar la función de ERK relacionada con la polarización de los macrófagos en la AR.61,62 El cambio metabólico durante y después de la polarización de los macrófagos es muy complejo y aún queda mucho por investigar. Una mejor comprensión de las interacciones entre el metabolismo energético y la polarización de los macrófagos puede ayudar a descubrir más agentes terapéuticos para la AR que dependan de mecanismos diferentes a los de los medicamentos actuales.

Una cuestión interesante es hasta qué punto el daño tisular causado por la AR es irreversible. En este estudio, es bastante notable que los RBA-NP repararon parcialmente el daño óseo existente (Fig. 4). En pacientes con AR, la osteoporosis secundaria es común porque el mayor número de osteoclastos altera gravemente el equilibrio osteoclastos-osteoblastos y mejora la resorción ósea. Por lo tanto, la repolarización de M1 a M2 de los macrófagos articulares pareció detener la resorción ósea en curso y permitir el proceso de reparación natural de los huesos dañados. Consistentemente, los macrófagos M2 podrían producir citocinas antiinflamatorias y mejorar la remodelación tisular en la AR.19 Por lo tanto, nuestro estudio amplía la indicación médica de la RBA y respalda una forma de tratar la enfermedad secundaria en la AR. No obstante, aún queda por explorar cómo el reequilibrio de los macrófagos afecta la cantidad de osteoclastos y osteoblastos.

En conclusión, construimos una nanomicela autoensamblada con sensibilidad al pH y capacidad de focalización del receptor CD44/folato para administrar RBA. Las micelas diseñadas con núcleos hidrofóbicos encapsularon eficientemente RBA. Las RBA-NP mostraron una acumulación significativamente mayor en las articulaciones con artritis y una fuerte superposición con los macrófagos M1. Como resultado, las RBA-NP ofrecieron un fuerte resultado terapéutico anti-AR al reprogramar los macrófagos M1 a M2 para restringir la expresión de citoquinas inflamatorias y promover la reparación de tejidos. También descubrimos que las RBA-NP inducían este cambio fenotípico de M1 a M2 mediante el bloqueo de la vía ERK/HIF-1α/GLUT1. Por lo tanto, en este estudio, fabricamos un agente nanoterapéutico anti-RA eficaz basado en RBA, revelamos su mecanismo y proporcionamos un ejemplo para modificar inversamente el tipo de célula mediante la regulación de las vías metabólicas.

El ácido robúrico (RBA, CAS: 6812-81-3; catálogo B20723) se obtuvo de Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd (Shanghai, China). El ácido hialurónico sódico (HA, peso molecular: 11,5 Kd) se adquirió de Freda Biopharm Co. Ltd (Shandong, China). El ácido fólico (AG) se adquirió de Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). NH2-PEG-FA y Fmoc-PEG-OH se adquirieron de Ruixi Biotech Co. Ltd.

Se compraron ratas Sprague-Dawley macho sanas (180–220 g) y ratones BALB/c macho (18–22 g, 6 semanas de edad) de Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd. (Chengdu, China). Los murinos se mantuvieron en una habitación con temperatura controlada (24 ± 2 °C) y humedad (55%) con libre acceso a alimentos y agua. Los experimentos con animales en este estudio se realizaron de acuerdo con el estatuto nacional de China con respecto a los animales de experimentación y fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética y Cuidado de Animales de la Universidad de Sichuan. La línea celular murina RAW264.7 se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC, EE. UU.). Como medio de cultivo celular se utilizó medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con penicilina y estreptomicina al 1%, que incluía suero bovino fetal al 10% (GIBCO, EE. UU.). Las células se incubaron en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.

La síntesis del polímero FA-HA-PAE implicó tres pasos.

Paso 1: Se disolvieron HA (500 mg), NH2-PEG-FA (2,5 eq.), EDC (4,0 eq.) y NHS (4,0 eq.) en formamida anhidra a 40 °C (15 ml) y se hicieron reaccionar durante la noche a 40 °C. °C. La solución de reacción se vertió en una gran cantidad de acetona para precipitar y se obtuvo FA-HA mediante filtración.

Paso 2: Se disolvieron Fmoc-PEG-OH (2 g), cloruro de acriloilo (2,0 eq.) y trietilamina (2,0 eq.) en 20 ml de cloroformo y se agitaron a temperatura ambiente durante 12 h, seguido de lavado tres veces en agua. . Los productos se secaron con sulfato de sodio anhidro. Después de la concentración por descompresión, se vertió una gran cantidad de éter helado en la precipitación y los productos se recogieron mediante centrifugación. El Fmoc-PEG-propileno se obtuvo mediante secado al vacío. El poli (β-amino éster) (PAE) se sintetizó mediante polimerización por adición de Michael. Se disolvieron Fmoc-PEG-propileno (1 g), 1,6-bis(acriloiloxi)hexano (10,0 eq.) y 1,3-bis-(4-piperidina)propano (11,0 eq.) en 20 ml de cloroformo y Se agitó a 55 °C durante 48 h. Después de la descompresión y concentración, la solución de reacción se vertió en una gran cantidad de éter helado para precipitar y los productos se filtraron y recogieron. Los Fmoc-PEG-PAE se obtuvieron mediante secado al vacío. Se disolvieron Fmoc-PEG-PAE (1 g) y piperidina (3 ml) en 10 ml de cloroformo y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de lavado tres veces en agua. El producto se secó con sulfato de sodio anhidro. Después de la concentración por descompresión, se vertió una gran cantidad de éter helado en la precipitación y los productos se filtraron y recogieron. Los productos NH2-PEG-PAE se obtuvieron mediante secado al vacío.

Paso 3: Se disolvieron FA-HA (500 mg), NH2-PEG-PAE (6,0 eq.), EDC (7,5 eq.) y DMAP (0,5 eq.) en formamida anhidra a 40 °C (15 ml) y se hicieron reaccionar durante la noche. a 40°C. La solución de reacción se vertió en una gran cantidad de acetona para precipitar. El FA-HA-PAE se obtuvo mediante filtración.

Las micelas podrían fabricarse mediante la capacidad de autoensamblaje de los polímeros FA-HA-PAE. Se disolvieron 5 mg de RBA y 15 mg de copolímero FA-HA-PAE (copolímero RBA:FA-HA-PAE = 1:3, ww) respectivamente en 5 ml de DMSO y 30 ml de agua desionizada y luego se mezclaron. La mezcla se emulsionó mediante un ultrasonicador tipo sonda (Scientz, Ningbo, China) a 200 W durante 10 minutos para obtener RBA-NP. Para eliminar los medicamentos descargados y el exceso de disolvente DMSO, se cargaron RBA-NP en una bolsa de diálisis (MWCO = 7000 Da) frente a agua desionizada durante 24 h. Las NP en blanco se prepararon con el mismo método, excepto añadiendo RBA. Los tamaños de partículas y los potenciales zeta de las NP en blanco y las RBA-NP se caracterizaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) (Malvern ZetaSizer Nano ZS90, Reino Unido) y se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) (H-600, Hitachi, Japón) para monitorear sus morfologías. La concentración de RBA se determinó mediante espectrofotómetro UV-vis (Lambda 365, PerkinElmer, EE. UU.) con escaneo de longitud de onda completa, con la longitud de onda de máxima absorción a 210 nm. En el caso de las NP cargadas con DiD, se utilizó el tinte lipófilo DiD en lugar de RBA.

La liberación acumulada de RBA se midió utilizando una técnica de diálisis dinámica en diferentes condiciones de pH. Las RBA-NP (1 mg) se colocaron en una bolsa de diálisis (MWCO = 7000 Da) y luego se sumergieron en 20 ml de tampón PBS en Tween 80 al 0,5 % a pH 7,4, 6,8 y 5,0 por turnos. En ciertos intervalos de tiempo (0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 36, 48 y 72 h), se extrajo 1 ml del medio de liberación y se reemplazó con un volumen equivalente de medio nuevo. Luego se determinaron las concentraciones de RBA liberado mediante espectrofotómetro UV-vis.

Se sembraron células RAW264.7 en placas de 12 pocillos a una densidad de 1 x 106 células por pocillo con o sin LPS (100 ng/ml) e IFN-γ (20 ng/ml) y se cultivaron a 37 °C durante 24 h. . Los medios de cultivo celular se cambiaron con 1 ml de medio nuevo que contenía DiD-NP (1 μg/ml DiD). Después de 2 h de incubación, las células se lavaron 3 veces con PBS. Se utilizó un citómetro de flujo (BD FACSCelesta, EE. UU.) para analizar cuantitativamente la intensidad de fluorescencia de DiD. Las células se fijaron y se tiñeron con DAPI y luego se fotografiaron con un microscopio confocal de barrido láser (LSM 800, Zeiss, Alemania).

A la base de las colas de las ratas se les inyectó por vía subcutánea adyuvante completo de Freund (80 μl) que contenía 10 mg/ml de micobacterias muertas por calor (Chondrex, #7027, Washington DC, EE. UU.). El desarrollo de la progresión de la artritis se siguió diariamente y se estableció completamente 14 días después de la inyección.

A las venas de la cola de ratas AIA se les administró DiD o DiD-NP libres. Se recogieron las articulaciones del tobillo 24 h después de la última administración para preparar las secciones. Las secciones preparadas de rodajas de 10 μm de espesor se tiñeron con anticuerpo CD44 (Affinity Biosciences, DF6392, 1:500), anticuerpo CD68 (Affinity Biosciences, DF7518, 1:500) y anticuerpo FOLR2 (Affinity Biosciences, DF9518, 1:300). . Los núcleos se tiñeron con DAPI. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser (LSM 800, Zeiss, Alemania) para registrar las distribuciones fluorescentes en las articulaciones sinoviales.

A las venas de la cola de ratas AIA se les inyectaron DiD o DiD-NP libres. Después de la administración, se probó la biodistribución de DiD en las articulaciones del tobillo mediante la medición de imágenes in vivo de la intensidad de la fluorescencia utilizando un sistema de imágenes in vivo Caliper IVIS Lumina III (Perkin Elmer, EE. UU.) en puntos de tiempo específicos (0,5, 2, 6, 12, 24 y 48 h). Después de fotografiar, se sacrificaron las ratas y se recolectaron corazones, hígados, bazos, pulmones, riñones y patas para obtener imágenes in vivo. Se utilizó la imagen J (Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.) para cuantificar la intensidad de fluorescencia correspondiente. Se utilizaron como controles ratas AIA tratadas con NS.

La polarización de macrófagos M1 se logró tratando RAW264.7 con LPS (100 ng/ml) e IFN-γ (20 ng/ml) durante 24 h. La polarización de los macrófagos M2 se logró tratando el RAW264.7 con IL-4 (20 ng/ml) + IL-13 (20 ng/ml) durante 24 h. Se indujo a las células THP-1 a diferenciarse en macrófagos mediante la adición de acetato de miristato de forbol (PMA) 100 ng/ml durante 48 ~ 72 h. Se utilizaron macrófagos tipo M1 con tratamiento LPS (100 ng/mL)+IFN-γ (20 ng/mL) durante 48 h; Se utilizaron macrófagos tipo M2 IL-4 (20 ng/mL)+IL-13 (20 ng/mL) durante 48 h. Las células THP-1 son células adherentes después de la diferenciación. El cambio de macrófagos M1 a M2 fue inducido por RBA-NP (el equivalente a 20 μM de RBA) durante 24 h. Se utilizaron tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo para revelar las frecuencias de los macrófagos M1 y M2. Los niveles de los marcadores M1 (iNOS, TNF-α, IL-1β) y M2 (Arg-1, IL-10, TGF-β) se determinaron utilizando un ensayo ELISA. Las células se bloquearon con tampón de bloqueo (solución de PBS con BSA al 5%) y se fijaron con paraformaldehído al 4%, y luego se incubaron con anticuerpos primarios contra el anticuerpo PE anti-ratón CD68 (Biolegend, 137013, 1:200), PE anti-ratón F4. Anticuerpo /80 (Biolegend, 123109, 1:100), anticuerpo PE anti-CD68 humano (Biolegend, 333807, 1:20), anticuerpo FITC anti-CD86 de ratón (Biolegend, 105005, 1:100), APC anti-CD206 de ratón (MMR) (Biolegend, 141707, 1:100), anticuerpo anti-CD86 humano FITC (Biolegend, 374203, 1:20) y anticuerpo APC anti-CD206 humano (MMR) (Biolegend, 321109, 1:50) a 4 °C durante la noche. Después de contrateñirlas con DAPI, se utilizó el microscopio confocal de barrido láser (LSM 800, Zeiss, Alemania) para obtener imágenes de las secciones.

Para la tinción intracelular, las células se bloquearon mediante tampón de bloqueo (solución de PBS con BSA al 5%) y se incubaron con el anticuerpo CD86 anti-ratón FITC (Biolegend, 105005, 1:100) y el anticuerpo CD206 anti-ratón (MMR) APC (Biolegend, 141707, 1:100) a 4 °C durante 1 h en un lugar oscuro. Luego, las células se lavaron en PBS y se detectaron mediante citometría de flujo (BD FACSCelesta, EE. UU.). Los resultados se analizaron utilizando el software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, EE. UU.).

Las cuarenta ratas se dividieron en seis grupos al azar (n = 8): normales, ratas AIA con NS (NS), ratas AIA con dexametasona (0,5 mg/kg) (Dex), ratas AIA con RBA libre (5 mg/kg) ) (RBA), ratas AIA con NP en blanco (Blank NP), o ratas AIA con RBA-NP (dosis de 5 mg/kg para RBA) (RBA-NP) con administración intravenosa. Después de la inducción de la artritis, el tratamiento se administró los días 17, 20, 23 y 26. En el grupo NS, a las ratas AIA se les administró un volumen igual de solución salina. Durante el tratamiento, se evaluó el grosor de las articulaciones del tobillo cada dos días. El día 14, cada extremidad trasera se calificó en una escala de 0 a 4: 0 significa normal; 1 significa eritema y/o hinchazón leve; 2 significa enrojecimiento e hinchazón moderados; 3 significa hinchazón severa; 4 significa anquilosis e incapacidad para soportar peso. Las puntuaciones de las extremidades de cada ratón se sumaron para producir una puntuación máxima de 16. El día 28, las ratas se sacrificaron mediante anestesia (pentobarbital sódico, 65 mg/kg, intraperitoneal). Se tomaron y pesaron inmediatamente el timo y el bazo. Los índices de timo y bazo se calcularon respectivamente dividiendo el peso húmedo del timo y del bazo por el peso corporal (mg/10 g).

Veintiocho días después de la inducción de la artritis, se sacrificaron todas las ratas. Se extirparon las articulaciones del tobillo y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Las articulaciones del tobillo se descalcificaron y fijaron con ácido etilendiaminotetraacético tetrasódico al 15% durante 2 meses. Las secciones se cortaron con un espesor de 3 µm después del procesamiento para su inclusión en parafina, seguido de tinción con hematoxilina-eosina (HE) y Safranin-O Fast-Green. Se utilizó un microscopio óptico (Olympus BX53, Tokio, Japón) para observar la tinción.

Se aplicó paraformaldehído al 4% para reparar las articulaciones del tobillo recolectadas antes y dos días después del último tratamiento. Luego se usó una solución de ácido etilendiaminotetraacético tetrasódico al 15 % para descalcificar las articulaciones fijas del tobillo. Se descalcificaron con cambios diarios de una solución de ácido etilendiaminotetraacético tetrasódico al 15 % (p/v) durante 2 meses. Las juntas descalcificadas se incluyeron posteriormente en parafina y luego se seccionaron para teñirlas. Se utilizaron kits comerciales del complejo de estreptavidina-biotina (SABC) (Boster, Wuhan, China) para inmunolocalizar el anticuerpo policlonal ALP (Invitrogen, PA5-106391, 1:200), anti-RANKL (Abcam, ab239607, 1:100), anti- OPG (Abcam, ab203061, 1:200), anticuerpo policlonal IL-6 (Proteintech, 23457-1-AP, 1:100), anticuerpo policlonal IL-1 beta (Proteintech, 26048-1-AP, 1:100), Anticuerpo monoclonal TNF Alfa (Proteintech, 60291-1-Ig, 1:500) en las articulaciones. Se aplicó el kit de tinción TRAP (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) para teñir estas secciones siguiendo las instrucciones.

Todas las ratas fueron sacrificadas el día 28 después de la inducción de la artritis. Después de fijarlo en paraformaldehído a una concentración del 4%, se utilizó una microtomografía computarizada ex vivo (Micro-CT, SCANCO MEDICAL VivaCT 80, Suiza) para escanear las articulaciones del tobillo a 70 kV y 113 μA con una resolución de 15 μm. . Las imágenes en 3D de las articulaciones y trabeculares del fémur distal se crearon reconstruyendo el conjunto de datos. Además, se realizaron análisis cuantitativos para ciertas características morfométricas, como la densidad mineral ósea (DMO), la superficie ósea versus el volumen óseo (BS/BV), la separación trabecular (Tb.Sp) y el espesor del hueso trabecular (Tb.Th).

A ratas sanas (200 ± 20 g) se les inyectaron por vía intravenosa 5 mg/kg de RBA, NP en blanco o RBA-NP para investigar la seguridad in vivo de RBA-NP. Las ratas tratadas con un volumen equivalente de solución salina se establecieron como grupo NS. Las ratas fueron sacrificadas dos días después de la dosis final y se extirparon órganos clave, incluidos el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones y los riñones, para realizar análisis histológicos, como se informó anteriormente. Los niveles de alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), creatina quinasa (CK) y láctica deshidrogenasa (LDH), creatinina (CREA), ácido úrico (UA), glóbulos blancos (WBC), glóbulos rojos (RBC) ), y las plaquetas (PLT) en el suero obtenido de las ratas administradas se analizaron en un analizador bioquímico automático Hitachi 7020 (Hitachi, Japón). El edema del tejido pulmonar se evaluó mediante la relación W/D del pulmón. Los tejidos pulmonares se dividieron del lóbulo pulmonar superior izquierdo. Después de eliminar el agua, los tejidos se pesaron primero y se volvieron a pesar y luego se deshidrataron a 80 °C durante 24 h. Los resultados fueron concluyentes al dividir el peso húmedo por el peso seco.

Las células RAW264.7 se lavaron tres veces en PBS preenfriado antes de centrifugarlas a 1000 g durante 5 minutos a 4 °C. Después de eliminar el sobrenadante, las muestras se incubaron durante 5 minutos en tampón de lisis (Tris-HCl 40 mM, SDS al 4%, tiourea 2 M, urea 7 M, pH 8,5) que contenía EDTA 2 mM, PMSF 1 mM y DTT 10 mM. Luego, la suspensión se sonicó en hielo durante 5 a 15 minutos antes de centrifugarse durante 20 minutos a 13.000 rpm, 4 °C. Se añadió al sobrenadante una solución de acetona preenfriada de cuatro volúmenes a -20 °C durante 2 h. La centrifugación de los sedimentos de proteínas y la resuspensión en una solución de urea/TEAB que contenía urea 8 M y TEAB 100 mM (pH 8,0) fueron seguidas por secado al aire. Las muestras de proteínas se redujeron durante 30 minutos a 56 °C con DTT 10 mM, luego se alquilaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con yodoacetamida (IAM) 50 mM. Se agregaron a la muestra 4 volúmenes de acetona preenfriada a -20 ° C durante 2 h para su centrifugación. Los sedimentos de proteína secados al aire se resuspendieron en la solución de urea/TEAB mencionada anteriormente. La concentración de proteína total se evaluó según el método de Bradford. Para la digestión tríptica, se empleó una cantidad equivalente de proteína de cada muestra (aproximadamente 100 μg). La tripsina se introdujo en una proporción de enzima a proteína de 1:50 (p/p). Después de la digestión a 37 °C durante 12 a 16 h, se utilizaron columnas C18 para desalar los péptidos que luego se secaron con un medidor de concentración al vacío. La tripsina se introdujo en una proporción enzima-proteína de 1:50 (p/p) y la digestión se llevó a cabo a 37 °C durante 12 a 16 h. Los péptidos se desalinizaron usando columnas C18 después de la digestión, y los péptidos desalados se secaron usando un rotavapor.

Los mapas de calor se dibujaron usando Perseus (1.6.2.2). Se utilizó GeneCodis 3.0 para el análisis de rutas GO y KEGG. Se utilizó FDR (valor q) para seleccionar proteínas de interés. En los resultados cuantitativos, se consideró que la proteína cambiada se expresaba diferencialmente cuando el cambio de la proteína era >1,5 o <0,667 y el valor de p era <0,05.

Los resultados cuantitativos se proporcionaron como media ± desviación estándar. Se utilizó la prueba t bilateral de Student para el análisis estadístico de una comparación de dos grupos. Para comparaciones múltiples, se utilizó un análisis de varianza bidireccional (ANOVA). Se consideró una diferencia significativa con un valor de P <0,05.

Los autores declaran que los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y sus materiales complementarios. Todos los datos generados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios. Todos los datos de este estudio están disponibles del autor correspondiente con una solicitud razonable. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio de socios de iProX63,64 con el identificador de conjunto de datos PXD042274.

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Este trabajo fue apoyado por el Fondo Nacional de Ciencias para Jóvenes Académicos Excelentes (No: 82022070) y el Fondo Conjunto Regional de Innovación y Desarrollo (No: U20A20411).

Laboratorio clave de sistemas de administración y focalización de fármacos, Ministerio de Educación, Facultad de Farmacia de China Occidental, Facultad de Ciencia e Ingeniería de Polímeros, Laboratorio estatal clave de Ingeniería de Materiales Polímeros, Escuela de Salud Pública de China Occidental y Cuarto Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, Chengdu, 610041, República Popular China

Na Jia, Yunzhen Gao, Min Li, Yi Liang, Yunzhu Lin, Shiqi Huang, Qing Lin, Xun Sun, Qin He, Yuqin Yao, Ben Zhang, Zhirong Zhang y Ling Zhang

Departamento de Farmacia, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, Chengdu, 610041, China

Yuwen Li

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Todos los autores han leído y aprobado el artículo. Conceptualización: NJ, LZ y ZRZ Metodología: NJ, YZG, ML y YL Investigación: NJ, YWL, QH, YQY y BZ Visualización: NJ, ML y YZL Adquisición de financiamiento: LZ y ZRZ Administración de proyectos: NJ, ZRZ , LZ, QL y XS Supervisión: LZ y ZRZ Escritura-borrador original: NJ, LZ, YZG y SQH Escritura-revisión y edición: NJ, LZ y ZRZ

Correspondencia a Ling Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

La reprogramación metabólica de los macrófagos proinflamatorios mediante ácido robúrico administrado de manera efectiva mejora eficazmente la artritis reumatoide

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Jia, N., Gao, Y., Li, M. et al. La reprogramación metabólica de los macrófagos proinflamatorios mediante el ácido robúrico administrado de manera efectiva mejora los síntomas de la artritis reumatoide. Sig Transduct Target Ther 8, 280 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01499-0

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Recibido: 22 de octubre de 2022

Revisado: 07 de mayo de 2023

Aceptado: 15 de mayo de 2023

Publicado: 28 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-023-01499-0

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