Novela Venetina

Aug 08, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 18497 (2022) Citar este artículo

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La presente investigación muestra la actividad antitumoral de un complejo proteína-polisacárido Venetin-1 obtenido del líquido celómico de las lombrices Dendrobaena veneta contra las células cancerosas A549. Las investigaciones son una continuación de los experimentos sobre la actividad antitumoral del líquido celómico obtenido de esta especie. La nanopartícula Venetin-1 se obtuvo después del tratamiento térmico del líquido celómico, la separación de los celomocitos, la filtración y la liofilización. El preparado mostró un efecto selectivo sobre las células cancerosas, mientras que las células normales no se vieron afectadas. Venetin-1 fue eficaz contra las células de cáncer de pulmón en dosis de 31,3 y 62,5 µg/ml, y las imágenes de los resultados se obtuvieron mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de barrido (SEM). Las células murieron principalmente por vía de apoptosis. Las células necróticas aparecieron esporádicamente en la vista microscópica. Las imágenes SEM revelaron la destrucción completa de las células A549 después de la incubación con Venetin-1. Los análisis de microscopía de fuerza atómica (AFM) mostraron cambios en la topografía, imágenes de error de fuerza máxima y módulo de Young (elasticidad) de las células A549 después de la incubación con Venetin-1. El análisis por criomicroscopía electrónica de transmisión (Cryo-TEM) indicó una naturaleza polimérica de la preparación analizada. Las muestras de Venetin-1 mostraron un perfil de tamaño muy homogéneo con un tamaño de micropartícula de aproximadamente 58,23 nm. Se observó una disminución significativa en la unión de Venetin-1 a esfingomielina. Venetin-1 perdió su actividad formadora de poros o se produjo una desactivación de la actividad formadora de poros. Esto confirma la ausencia de capacidad hemolítica de Venetin-1 hacia los glóbulos rojos. Los análisis realizados muestran la idoneidad del complejo obtenido para la investigación biomédica. El siguiente paso consistirá en analizar el efecto de Venetin-1 sobre el sistema inmunológico en ratones.

En el grupo de las enfermedades no transmisibles, el cáncer es la causa más común de muerte. El cáncer de pulmón se caracteriza por la mayor mortalidad entre hombres y mujeres en todo el mundo1,2. El tabaquismo es la causa más común de desarrollo de cáncer de pulmón. El humo del tabaco contiene alrededor de 4.000 sustancias, de las cuales aproximadamente 50 compuestos se clasifican como tóxicos, irritantes o cancerígenos1,3,4. Las personas expuestas al tabaquismo pasivo también corren riesgo de sufrir cáncer de pulmón. Los metabolitos de la nicotina pueden detectarse en la orina de los fumadores pasivos, lo que indica que los no fumadores inhalan diversos componentes del humo del tabaco3. Los componentes del humo del tabaco causan trastornos en el genoma celular, por ejemplo, deleción o amplificación del ADN, metilación incorrecta e incluso pérdida o ganancia de cromosomas completos2.

Aunque el 85% de los cánceres de pulmón se desarrollan en fumadores de tabaco, el resto de casos se diagnostican en quienes nunca han fumado. Una de las causas no relacionadas con el tabaco del cáncer de pulmón es la contaminación del aire, predominantemente la presencia de oxígeno sulfuroso, oxígeno nitrógeno o polvo con un diámetro inferior a 2,5 µm5,6. En Estados Unidos, la principal causa de cáncer de pulmón es el radón, es decir, el producto de la desintegración del radio presente en el suelo. Este gas es la causa del 40% de las muertes por cáncer y la mayoría de estos pacientes no han fumado durante toda su vida1. Los investigadores también han identificado genes responsables de la susceptibilidad al desarrollo del cáncer de pulmón, es decir, mutaciones de la línea germinal en los genes p53 y EFGR, polimorfismo del gen SNP o trastornos en los genes de reparación del ADN, por ejemplo, ERCC12,7.

El cáncer de pulmón se diagnostica en personas de alrededor de 70 años. Se pueden clasificar en dos tipos principales: SCLC (carcinoma de pulmón de células pequeñas) y NSCLC (carcinoma de pulmón de células no pequeñas). Aproximadamente el 85% de los cánceres de pulmón son NSCLC2. Suelen tener mal pronóstico debido a la detección tardía y al estadio avanzado del desarrollo del cáncer8. Los SCLC a menudo se encuentran en las vías respiratorias más grandes, lo que provoca oclusiones bronquiales. Estos cánceres suelen ser bastante grandes y suelen metastatizar en los ganglios linfáticos9.

Se ha documentado que muchos compuestos de origen natural vegetal, fúngico o animal pueden destruir las células cancerosas de pulmón. Por ejemplo, el extracto de albahaca asiática de Ocimum sanctum mostró citotoxicidad para las células de cáncer de pulmón A549, aumentó la población sub-G1 e influyó en la aparición de cuerpos apoptóticos en las células cancerosas10. Otros estudios demostraron que Phyllanthus podía inducir toxicidad selectiva en las células A549. Además, ejerció un efecto inhibidor en las etapas críticas de la metástasis, incluidas la migración y la invasión11. A su vez, Ramalakshmi et al.12 encontraron actividad citotóxica del extracto etanólico de hojas de Coleus amboinicus contra células de cáncer de pulmón A549. Su citotoxicidad después de 72 h de incubación con células de cáncer de pulmón A549 fue del 94%.

Wei-Sheng et al.13 demostraron que la bostricina (hidroxi-metoxi-tetrahidro-5-metilantraceno) de hongos marinos inhibía la proliferación de células A549 de una manera dependiente de la dosis y el tiempo de incubación, detenía el ciclo celular en G0/G1 y apoptosis estimulada. Se demostró que la picnidiona aislada del hongo Theissenia rogersii reduce la proliferación de células de adenocarcinoma de pulmón A549 mediante la detención del ciclo celular en la fase G1. Además, se descubrió que estimula la apoptosis a través de vías externas e internas. La picnidiona también provocó una disminución en el potencial de membrana mitocondrial y un aumento significativo en el nivel de especies reactivas de oxígeno y proteína PAI-1 en las células A54914. En la medicina china, las propiedades anticancerígenas de los compuestos aislados de Ganoderma spp. contra el cáncer de pulmón son bien conocidos15.

Respecto a las preparaciones de origen animal, Arulvasu et al.16 demostraron que la emulsión de aceite de sardina (Sardinella longiceps) inducía la apoptosis e inhibía la proliferación de células de cáncer de pulmón A549 de manera dependiente de la dosis y el tiempo de incubación. El probable mecanismo de acción de los ácidos Ω-3 consiste en la interacción con la membrana celular y la inhibición de las enzimas de la membrana, lo que conduce a la apoptosis de las células neoplásicas. En el caso de los invertebrados, se ha observado que las proteínas del líquido celómico de las lombrices también muestran actividad antitumoral, por ejemplo contra el cáncer de pulmón17.

Las lombrices de tierra son una fuente de sustancias anticancerígenas. Estos anélidos se utilizan en la medicina del Lejano Oriente, por ejemplo, en Vietnam, China o Corea, para el tratamiento de muchas enfermedades, por ejemplo, quemaduras, asma, bronquitis, enfermedades cardiovasculares o úlceras gastrointestinales17,18. En su hábitat, que posee una rica microbiota y asegura un contacto constante entre microorganismos y lombrices, estos animales han desarrollado mecanismos que previenen el desarrollo de enfermedades18,19,20,21. Las formulaciones más populares a base de lombrices de tierra son los polvos y las pastas20,21,22,23,24. Se ha evidenciado que el líquido celómico es rico en proteínas, enzimas, péptidos y polisacáridos. Tiene propiedades fibrinolíticas, ejerce efectos vasorelajantes y tiene propiedades beneficiosas para el hígado17,18,22. Las preparaciones de lombrices de tierra tienen propiedades antibacterianas y antifúngicas documentadas20,21,24,25,26,27,28. Las investigaciones actuales han demostrado que el líquido celómico tiene actividad anticancerígena contra las líneas celulares cancerosas HeLa, A549, Pa17, PC-12 o Hep-220,26,29. Se ha propuesto un mecanismo de acción del líquido celómico contra las células cancerosas basado en la limitación de la absorción de glucosa por las células20. Además, se ha demostrado que el líquido celómico no tiene efectos citotóxicos contra los fibroblastos o eritrocitos humanos25,30. Estas propiedades hacen que los productos derivados de lombrices sean agentes prometedores en la terapia del cáncer.

Los efectos de Venetin-1 sobre la proliferación de las células BEAS-2B y A549 se determinaron mediante el uso del ensayo MTT durante 24, 48 y 72 h (Fig. 1). Aunque la línea celular A549 era aproximadamente 80-90% viable después de la exposición de 24 y 48 h a las diferentes concentraciones de Venetin-1 (15,6-500 μg/mL), su viabilidad después de la incubación de 72 h disminuyó significativamente al 52%. , 41% y 32% en las concentraciones de Venetin-1 de 125 μg/mL, 250 μg/mL y 500 μg/mL, respectivamente (Fig. 1A). La viabilidad de las células BEAS-2B disminuyó al 75% en el grupo tratado con 500 μg/ml de Venetin-1 a las 72 h (Fig. 1B). En concentraciones más bajas, las células BEAS-2B parecieron exhibir una mayor tolerancia a Venetin-1, con mayor viabilidad (80-100%) en todas las demás concentraciones de Venetin-1 después del período de 72 h.

Resultados del ensayo MTT y efectos de las concentraciones indicadas de Venetin-1. (A) Curvas dosis-respuesta para Venetin-1 en células A549 después de una incubación de 24 h, 48 h y 72 h. (B) Comparación de la actividad citotóxica de Venetin-1 contra células A549 de cáncer de pulmón y células BEAS-2B normales después de 72 h de incubación. Los datos se presentan como medias ± desviación estándar (DE) de 3 experimentos independientes. *p < 0,05; **p<0,01. Venetin-1 en una concentración en el rango de 125 a 500 μg / ml después de la incubación de 72 h causó una disminución significativa en la viabilidad de las células A549, pero no indujo cambios significativos en la viabilidad de las células BEAS-2B.

La muerte celular apoptótica inducida por el extracto de Venetin-1 se investigó mediante el seguimiento de la translocación de fosfatidilserina (PS) utilizando el ensayo Anexina V-FITC/PI. Según la capacidad de la anexina V para unirse a la PS, que se localiza en la membrana interna de las células viables, las células se clasificaron de la siguiente manera: LL: células viables (Anexina V-/PI-), LR: células apoptóticas tempranas ( Anexina V+/PI-), UR: células apoptóticas tardías (Anexina V+/PI+) y UL: células necróticas (Anexina V-/PI+).

Observamos que el tratamiento de 72 h con Venetin-1 tuvo un impacto necrótico y apoptótico en las células A549 (Fig. 2). El número de células viables se redujo significativamente de 77,03 ± 2,62 % en el control a 48,41 ± 0,92 % después de la incubación de 72 h con 125 µg/ml de Venetin-1. En comparación con las células de control, se observó una mayor cantidad de células necróticas (~ 5%) y apoptóticas tempranas (~ 3%) en las células A549 tratadas con Venetin-1. Además, las células exhibieron una tasa de apoptosis tardía notablemente mayor, en comparación con las células no tratadas (24,31 ± 0,57 frente a 2,18 ± 0,27) (Tabla 1). Los resultados de la actividad de Venetin-1 contra las células epiteliales pulmonares normales (BEAS-2B) se presentan en los materiales complementarios (Figura complementaria S1).

Actividad apoptótica y necrótica de Venetin-1 en células A549 evaluadas con el ensayo de tinción con Anexina V/PI. El panel (A) muestra diagramas de puntos representativos de células de control A549 (sin incubación con Venetin-1) después de la doble tinción con Anexina V-FITC y PI. El panel (B) muestra los efectos de la incubación con Venetin-1 (125 g/ml) durante 72 h sobre la apoptosis celular en células A549. Las células se clasificaron como células viables (cuadrado inferior izquierdo), células apoptóticas tempranas (cuadrado inferior derecho), células apoptóticas tardías (cuadrado superior derecho) y células necróticas (cuadrado superior izquierdo). Se muestran imágenes representativas de tres experimentos independientes. Venetin-1 tuvo un efecto necrótico y apoptótico en las células A549. La tasa de necrosis y de apoptosis temprana y tardía en las células A549 tratadas con Venetin-1 fue mayor en un 5%, 3% y 22,13%, respectivamente, que en el control.

Para examinar el efecto potencial del tratamiento con Venetin-1 en el ciclo celular, las células A549 se trataron con 125 µg/ml de Venetin-1 durante 72 h, se tiñeron con PI y se sometieron a análisis de citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 3, las células A549 tratadas fueron detenidas en la fase sub-G1 con un aumento sustancial (p <0,0001) en el número de células apoptóticas (1,13 ± 0,08% frente a 36,63 ± 0,61%). La incubación con Venetin-1 también provocó una disminución concomitante en la proporción de células en G1 (40,94 ± 0,94% vs 30,44 ± 0,57%, p = 0,0001), S (25,56 ± 0,65% vs 18,36 ± 0,50%, p = 0,0001) y G2/M (31,36 ± 0,35% vs. 15,32 ± 0,38%, p < 0,0001) fases del ciclo celular en las células A549 tratadas, en comparación con el control.

Efecto del tratamiento con Venetin-1 sobre las fases del ciclo celular A549. (A) Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo en células de control A549 y aquellas tratadas con Venetin-1 (125 µg/mL) durante 72 h. La distribución del ciclo celular de las células marcadas con PI se analizó mediante análisis de citometría de flujo. Los picos en la ilustración corresponden a las fases sub-G1 (puerta M1), G1 (puerta M2), S (puerta M3) y G2/M (puerta M4) del ciclo celular. (B) Histograma que muestra los porcentajes de células en cada fase del ciclo celular. Los resultados se expresan como valores medios ± DE de tres experimentos independientes. Los valores de p inferiores a 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01), en comparación con el grupo de control, se consideran estadísticamente significativos. El tratamiento con Venetin-1 provocó la detención de las células A549 en la fase sub-G1 con un aumento en el número de células apoptóticas y una reducción visible en las proporciones de células A549 tratadas y de control en las otras fases del ciclo celular.

El nivel de caspasas 3, 6, 8, 9, 12 y 18 se determinó en homogeneizados de células normales y neoplásicas con y sin Venetin-1 (Fig. 4). En el cultivo de células de cáncer de pulmón A549, el nivel de cada una de las caspasas analizadas fue mayor en los cultivos suplementados con Venetin-1 a una concentración de 125 µg/ml que en los cultivos no tratados. El nivel de caspasas en el cultivo de células BEAS-2B normales con la adición de Venetin-1 a una concentración de 125 µg/ml no difirió significativamente entre los dos grupos estudiados.

Concentraciones de caspasas 3, 6, 8, 9, 12 y 18 en cultivos de células BEAS-2B y A549. *p < 0,05. El mayor aumento en la concentración de las caspasas analizadas se observó en el cultivo de células de cáncer de pulmón A549 tratadas con Venetin-1.

Después de la incubación con Venetin-1 (125 µg/mL), el mayor aumento en la concentración de caspasas 3, 6, 8 y 9 se registró en el cultivo de células de cáncer de pulmón A549. El mayor aumento en la concentración de caspasa 12 se registró en el cultivo de células de cáncer de pulmón A549 incubadas con el compuesto activo (Fig. 4). Se observó una ligera disminución en la concentración de caspasa 12 en el cultivo de células BEAS-2B con la adición de Venetin-1 (125 µg/ml). El mayor aumento en la concentración de caspasa 18 después de la incubación con Venetin-1 se observó en el cultivo de células de cáncer de pulmón A549. Se observó una ligera disminución en la concentración de caspasa 18 en el cultivo de células normales incubadas con Venetin-1. Los datos completos están disponibles en Materiales complementarios (Tabla complementaria S2).

El análisis del cultivo de control A549 y sus variantes incubadas con 62,5 y 125 µg/ml de Venetin-1 mostró que las células tratadas con la fracción activa eran menos perceptibles bajo la lente y estaban deformadas. Con frecuencia se observaron cambios citopáticos en las células. Además, se observaron células fuertemente degradadas o en desintegración (Fig. 5a).

Visualización de células A549 tratadas con Venetin-1 con el uso de microscopía de luz transmitida y fluorescencia: (a) efecto citotóxico de Venetin-1 en A549. A: cultivo de control de A549, B: A549 después de 72 h de incubación con Venetin-1 (62,5 µg/ml) con una citotoxicidad del 78 %; C1, C2: A549 después de 72 h de incubación con Venetin-1 (125 µg/ml) con una citotoxicidad del 48 %. Las células se visualizaron utilizando un microscopio Zeiss Axiovert 40CFL (Carl Zeiss). La barra de escala corresponde a 20 µm. Las imágenes representan 10 imágenes. Las células tratadas con Venetin-1 se deformaron y degradaron; (b) efectos apoptóticos y necróticos en células A549 después de 72 h de incubación con Venetin-1. A: cultivo de control de A549, B: células A549 tratadas con Venetin-1 (62,5 µg/ml), C1, C2: células A549 tratadas con Venetin-1 (125 µg/ml). Las flechas amarillas indican células apoptóticas con clara degeneración progresiva del núcleo. Las células rosadas se consideran necróticas. Las barras de escala corresponden a 50 µm. Cada imagen representa 10 fotografías capturadas.

También se tomaron imágenes de los cultivos observados bajo el microscopio de luz transmitida utilizando un microscopio confocal después de la aplicación de una mezcla de tintes fluorescentes para identificar células necróticas y apoptóticas. Las células de control se caracterizaron por un núcleo fluorescente oscuro regular. Las células incubadas con Venetin-1 en concentraciones de 62,5 y 125 µg/ml tenían núcleos luminosos brillantes con material genético frecuentemente fragmentado. Las células que muestran signos de apoptosis están marcadas en la imagen con flechas. Las células necróticas eran esporádicas y emitían fluorescencia roja (Fig. 5b).

El cultivo de control y las células incubadas con Venetin-1 a una concentración de 125 µg/ml se observaron utilizando la técnica DIC. La técnica asegura el efecto de una superficie tridimensional. Se observó que las células A549 de control eran visiblemente más densas y compactas en la vista microscópica, como lo indica su color más oscuro y la mayor diversidad de la superficie observada (Fig. 6a A). Después del tratamiento con Venetin-1, las células se contrajeron, lo que se evidenció por la pigmentación oscura concentrada en la superficie celular más cercana a su centro (Fig. 6a B1, B2). La microscopía electrónica de barrido de las células tumorales facilitó la comparación de sus superficies entre los grupos de control y de incubación de Venetin-1 (125 µg/ml). La superficie de las células de control era rica en estructuras granulares finas (Fig. 6a A1, A2), mientras que las células tratadas con Venetin-1 no tenían estos gránulos y su superficie celular exhibía restos de estructuras dañadas (Fig. 6b B1, B2). ). El efecto de contracción celular también fue visible como grietas discernibles en la imagen microscópica (Fig. 6b B1).

Análisis DIC y SEM de células A549 después de la exposición a Venetin-1: (a) Imágenes DIC de células A549 después del tratamiento con Venetin-1 A: cultivo de control de A549 B1, B2: células A549 después de la incubación con Venetin-1 (125 µg/ml ). Las barras de escala corresponden a 20 µm. (b) Imágenes SEM de la superficie de las células A549 después del tratamiento con Venetin-1. A1, A2: cultivo de control de células A549, B1, B2: A549 después de la incubación con Venetin-1 (125 µg/ml). Las barras de escala corresponden a 10 µm. Después de la incubación con Venetin-1, la contracción y degradación de las estructuras celulares fueron visibles en la superficie de las células A549. Cada imagen representa 10 fotografías capturadas.

Las imágenes topográficas y de error de fuerza máxima capturadas por AFM en la superficie de las células A549 incubadas con 125 µg/mL de Venetin-1 revelaron diferencias (Fig. 7B1, B2) con respecto a las células de control (Fig. 7A1, A2). La amplitud media de las células de control A549 sometidas a la medición de la altura fue dos veces menor que la amplitud media de las células tratadas con Venetin-1. Las células A549 incubadas con Venetin-1 tenían una superficie marcadamente variada con muescas visibles en el perfil de altura (Fig. 7B1, B2). Para determinar las áreas de la superficie celular con la elasticidad más baja y más grande, se hizo un mapa del módulo de Young y se compararon los valores del módulo de Young para las áreas dadas. El valor medio del módulo de Young de las áreas con mayor elasticidad fue de 2120,7 MPa en el control y de 1142,8 MPa en las células A549 tratadas con Venetin-1. El módulo de Young de las áreas con menor elasticidad fue 2,3 veces menor (2647,4 MPa) en las células A549 incubadas con Venetin-1 que en las células de control (6300,9 MPa). En ambos casos las diferencias fueron estadísticamente significativas (p < 0,001; Prueba T de Student). Las imágenes de AFM indicaron cambios morfológicos y biofísicos apoptóticos en las células A549 causados ​​por el tratamiento con Venetin-1.

Análisis AFM de la superficie de la pared celular A549. (A1, A2) Cultivo de control de A549, (B1, B2) Células cancerosas incubadas con 125 µg/ml de Venetin-1. Imagen de gran altitud y error de fuerza máxima: panel izquierdo; perfil de altura e imagen 3D: panel derecho. El tratamiento con Venetin-1 provocó cambios en la topografía de la pared celular y las propiedades mecánicas de las células A549, y se observó una elasticidad significativamente menor expresada como módulo de Young.

Antes de la digestión enzimática de los componentes proteicos de Venetin-1 y DVr (líquido celómico crudo), las muestras se redujeron con DTT y se sometieron a separación electroforética en el sistema automático SageELF. Las proteínas se separaron en el modo basado en el tamaño en el rango de 10 a 300 kDa. Después de la separación, el sistema eluyó automáticamente las proteínas del gel en pocillos separados en el casete, desde donde se pipetearon en tubos Eppendorf y se digirieron según el protocolo FASP (cada fracción por separado). Los resultados de identificación de proteínas para Venetin-1 en cada fracción se presentan en la Tabla 2 (todos los resultados están disponibles en los Materiales complementarios, Tabla S3 para Venetin-1 y S4 para DVr de líquido celómico crudo). La identificación se realizó con base en la base de datos de proteínas revisada para Annelida (Uniprot).

Se determinó la unión del preparado Venetin-1 y su precursor, el DVr (líquido celómico crudo), recogido de lombrices de tierra y sin procesar (sin calentamiento ni diálisis), a dos lípidos: esfingomielina y POPC. Se prepararon soluciones de liposomas de 3 mM según el procedimiento descrito en la sección Materiales y métodos. Los lípidos se depositaron en el sensor L1 diseñado para estudiar la interacción de proteínas con lípidos. Luego, después de bloquear el sensor con una solución de albúmina, se realizó el procedimiento de unión de ambas preparaciones, y las proteínas unidas fueron eluidas y sometidas a análisis proteómico. Los sensogramas presentados en la Fig. 8 muestran la unión de las preparaciones a los lípidos. Hubo una reducción significativa en la unión de Venetin-1 a la esfingomielina en comparación con la preparación de DVr sin procesar. Se detectó una menor unión de DVr al lípido POPC. La unión de Venetin-1 a POPC fue más débil y se asoció con un rápido desprendimiento del complejo.

Análisis SPR de extractos de proteínas (DVr: líquido celómico crudo y Venetin-1) que se unen a SM (esfingomielina) y POPC (1-palmitoil-2-deoilphpsfatidilcolina). Los cambios observados se relacionaron con la reducción de la unión de Venetin-1 a la esfingomielina en comparación con la preparación de DVr no procesada, la menor unión de DVr al lípido POPC y la unión más débil de Venetin-1 a POPC.

El análisis proteómico de las fracciones recuperadas de los experimentos SPR mostró que en cada caso sólo se identificó una proteína, a saber, la proteína 2 relacionada con la lisenina (LRP2). La mayor cobertura de secuencia y la mayoría de los péptidos se identificaron en DVr. Para obtener más información, consulte la Tabla S5 en los materiales complementarios.

El compuesto activo Venetin-1 era visible al microscopio de barrido en forma de pequeños copos de distintos tamaños. Las estructuras más largas tenían aproximadamente 200 µm de longitud (Fig. 9A1,A2). También se observó la estructura de la preparación mediante la técnica Cryo-TEM. Se notó que las estructuras más pequeñas se agrupaban para formar una estructura circular más grande. La acumulación de las estructuras más pequeñas se indica con el círculo blanco en la Fig. 9B, mientras que las estructuras sueltas se indican con flechas. En la parte superior del ejemplar se ve una forma compacta y redonda. La imagen observada sugiere que la estructura de Venetin-1 es característica de un compuesto polimérico.

Imágenes de Venetin-1: (A1, A2) Imágenes SEM de Venetin-1; (B) Imágenes crio-TEM de Venetin-1. La imagen muestra pequeñas estructuras agrupadas en una más grande (marcada con un círculo blanco). Las estructuras sueltas están marcadas con flechas. En la parte superior de la imagen se ve una estructura compacta circular oscura formada por partículas más pequeñas.

El análisis mostró la presencia de carbono (64,1%), oxígeno (23,5%), nitrógeno (6,3%), fósforo (1,6%) y azufre (0,3%). Todos estos elementos son característicos de las proteínas. Las pruebas también mostraron la presencia de cloro (3,0%) y sodio (1,3%).

El espectro del estudio XPS de Venetin-1 se muestra en la Fig. 10. Los resultados cuantitativos del análisis XPS de la composición elemental de la superficie de Venetin-1 se presentan en la Tabla 3.

Espectro de encuesta XPS de Venetin-1. Se detectaron elementos característicos de las proteínas, entre ellos: carbono, nitrógeno, fósforo y azufre; adicionalmente se demostró la presencia de cloro y sodio.

Para identificar los enlaces químicos presentes en la preparación analizada, se obtuvieron espectros en un rango estrecho de energías de enlace para carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo. Después de una operación de ajuste basada en los datos de la literatura, los enlaces químicos se ajustaron a las energías de enlace individuales. La Figura 11 muestra los espectros en un rango estrecho de energía de enlace de XPS. La Tabla 4 presenta la composición elemental de Venetin-1 con identificación de enlaces químicos característicos.

Espectros XPS de Venetin-1 en un rango estrecho de energías de enlace para: (a) carbono, (b) oxígeno, (c) nitrógeno, (d) fósforo, (e) azufre.

El estudio mostró las características de unión tanto de los polisacáridos como de las proteínas. Los espectros en el estrecho rango de energías de enlace del carbono mostraron la presencia de enlaces C – C, C – H, C – OH, C = O y C – O – C en los polisacáridos. También se observó la presencia del enlace carboxílico O=C-OH característico de las proteínas. También se encontraron los grupos C=O y C–N característicos del enlace peptídico. Las pruebas realizadas en el estrecho rango de energía de enlace característico del nitrógeno mostraron la presencia de nitrógeno en forma de enlaces amina. Estos enlaces son característicos de las proteínas. La presencia de la forma orgánica de fósforo y azufre también confirma la presencia de proteínas en la preparación analizada.

Como se ve en la Fig. 12 y la Tabla 5, las muestras muestran un perfil de análisis de tamaño muy homogéneo con un tamaño de micropartícula determinado de 58,23 ± 3,93 nm.

Análisis de tamaño de micropartículas de Venetin-1 con Prometheus Panta DLS. La preparación resultó ser homogénea en el perfil de tamaño.

Luego del análisis de tamaño realizado con Prometheus Panta, se realizó un experimento de temperatura de fusión con un gradiente de temperatura de 25 a 95 °C y una rampa de calentamiento de 1 °C/min (Tabla 6). Como se muestra en la Fig. 12, las micropartículas mostraron una transición única de 350/330 nm a una temperatura de 64,95 ± 0,08 °C. Esta transición muy probablemente correspondió al punto de fusión de las micropartículas analizadas. Además, se determinó que, luego del cambio conformacional representado por la relación de fluorescencia 350/330 nm, las micropartículas analizadas experimentaron agregación con el Tagg 66,92 ± 0,16 °C y inicio de agregación 58,97 ± 1,15 °C.

Las fuentes renovables de medicamentos de origen animal, los preparados farmacéuticos basados ​​en estas fuentes y los aditivos alimentarios biológicos parecen ser una parte integral del progreso en la búsqueda de agentes terapéuticos eficaces. Este tipo de actividad humana debería mejorarse en todos los sentidos posibles. Los modelos animales convenientes contribuyen al desarrollo de la medicina complementaria y alternativa llamada medicina integrativa. Invertebrados como las lombrices de tierra son económicos, éticamente no controvertidos y útiles para comprender los mecanismos subyacentes a los procesos biológicos37. El uso de productos farmacéuticos derivados de las lombrices de tierra está muy desarrollado como medicina verde en China y otros países asiáticos. Los extractos preparados a partir de estos invertebrados se utilizan para tratar muchas enfermedades. Entre los invertebrados, las lombrices de tierra son una fuente conocida de compuestos antibacterianos, antifúngicos y anticancerígenos. El líquido celómico de la cavidad corporal de la lombriz exhibe muchos tipos de propiedades biológicas, por ejemplo, actividad antimicrobiana, proteolítica, hemolítica, hemaglutinante, antifúngica y antitumoral.

Nuestra investigación muestra que Venetin-1, caracterizada previamente como la fracción de proteína-polisacárido del líquido celómico de la lombriz de tierra D. veneta, tiene un efecto selectivo sobre las células del carcinoma de pulmón A549, destruyendo las células cancerosas y salvando las normales. El preparado se obtuvo mediante varios procesos, como extracción del fluido mediante descarga eléctrica, centrifugación, filtración, incubación y liofilización. Un paso particularmente importante fue privar al líquido de la citotoxicidad para las células normales manteniendo al mismo tiempo su alta actividad contra las células tumorales. Estos procesos se describieron en la publicación que describe la acción de fracciones del líquido celómico sobre las células de cáncer de pulmón A54929.

La preparación obtenida provocó la muerte celular por apoptosis. Desde el punto de vista de la oncología moderna, la apoptosis es un proceso muy importante que se activa en las células cancerosas. Las células cancerosas son inmortales por naturaleza. Se intenta diseñar medicamentos modernos para inducir la apoptosis (o algún otro tipo de muerte celular) solo en células anormales, dejando intactas las células sanas del cuerpo. En otras palabras, se induce farmacológicamente al tumor a suicidarse. La inducción del proceso de apoptosis es uno de los principales objetivos de las terapias anticancerígenas diseñadas. Esto está relacionado con los mecanismos desarrollados de resistencia de las células tumorales a la muerte programada. Los fármacos quimioterapéuticos actuales matan las células cancerosas principalmente mediante la inducción de la apoptosis. Sin embargo, se vuelven ineficaces cuando la célula neoplásica puede metastatizar, lo que se asocia con mal pronóstico y alta mortalidad38. Las células cancerosas suelen tener varias mutaciones genéticas que afectan el proceso apoptótico, evitando así la muerte celular programada. Esta resistencia a la apoptosis es beneficiosa para las células metastásicas38,39,40,41,42.

Las caspasas proteolizan las proteínas diana, lo que puede provocar su activación o inhibición, ejerciendo así un impacto significativo en el destino futuro de la célula. Realizan muchas funciones importantes en el organismo. Sobre todo, estas proteínas desempeñan un papel clave en la apoptosis. Además, están implicados en otros mecanismos de muerte celular como la piroptosis, la necrosis y la autofagia. También son importantes en el funcionamiento del sistema inmunológico y en los procesos inflamatorios mediante la estimulación de la secreción de citoquinas proinflamatorias. También participan en los procesos de envejecimiento. Algunas caspasas tienen propiedades anticancerígenas43,44,45,46,47. Las caspasas iniciadoras (caspasas 2, 8, 9 y 10) están involucradas en la fase inicial de la apoptosis y su función es mejorar la señal de muerte. También son responsables de la activación de las caspasas efectoras (caspasas 3, 6, 7). A su vez, tras la activación, las caspasas ejecutoras degradan rápidamente los elementos celulares43,47,48.

Los resultados actuales indican que Venetin-1 provoca un aumento estadísticamente significativo en la actividad de caspasa en células de cáncer de pulmón A549 cultivadas. El aumento de la concentración de caspasa 3, que pertenece al grupo de las caspasas ejecutoras, y la disminución del número de células vivas en el cultivo pueden indicar una intensificación del proceso de apoptosis en estas células tumorales tras la adición de Venetin-1. Sin embargo, el aumento de caspasa 12 sugiere que este preparado también puede ser importante en la inducción del proceso inflamatorio. El aumento en la concentración de caspasa 6 indica que Venetin-1 influye en la fase de ejecución de la apoptosis, y el aumento en la concentración de caspasas 8 y 9 refleja su influencia en la fase de iniciación. A su vez, no se encontraron cambios significativos en los parámetros probados después de la adición de Venetin-1 en el cultivo de células normales del epitelio bronquial del árbol bronquial BEAS-2B.

Las observaciones de microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido y microscopía de fuerza atómica revelaron cambios en la morfología y las propiedades nanomecánicas de las células tumorales después de la incubación con Venetin-1. Las imágenes microscópicas proporcionadas por las diferentes técnicas se complementaron. La microscopía de luz transmitida mostró una disminución en la densidad celular y deformación después de la incubación con el compuesto activo. Los cambios en los parámetros de la superficie celular A549, como la rugosidad, se detectaron mediante microscopía de fuerza atómica. La apoptosis temprana se caracteriza por la remodelación del citoesqueleto y el núcleo. Induce cambios dinámicos en las propiedades nanomecánicas de la superficie celular49. Macroscópicamente, la reducción de la densidad del cultivo también se evidenció mediante la técnica DIC.

La Venetina-1 aislada provocó un aumento significativo en el nivel de caspasas 3, 12 y 18 en las células de cáncer de pulmón A549 y al mismo tiempo indujo cambios en la viabilidad y densidad celular en estos cultivos. Esto indica que esta preparación ejerce su efecto antitumoral al estimular el proceso de apoptosis en las células de cáncer de pulmón A549.

Aunque describimos nuestra preparación como una fracción de proteína y polisacárido, en realidad es un complejo, ya que análisis electroforéticos anteriores de la misma mostraron que las señales provenientes de las proteínas se ubicaban exactamente en las mismas posiciones que las señales provenientes de los azúcares. Esto indica que estos compuestos de proteínas y azúcares están relacionados entre sí. Además, los análisis de espectroscopía FTIR demostraron la homogeneidad química de la preparación, ya que el espectro FTIR tenía el mismo aspecto en cada región analizada y tenía la misma intensidad. Otra observación que respalda la naturaleza del complejo es la imagen Cryo-TEM de la preparación, que mostró claramente estructuras idénticas más pequeñas fusionándose en una forma esférica más grande. Los análisis XPS de los enlaces químicos confirman esta teoría. Además, los análisis específicos del dominio de dispersión dinámica de la luz realizados con el uso de Prometheus Panta mostraron que Venetin-1, anteriormente considerada como una fracción de proteína-polisacárido, era una nanopartícula.

Análisis químicos previos realizados en estudios sobre actividad antifúngica27,28,30 mostraron que las proteínas de la familia de la lisenina: proteína relacionada con la lisenina 2 (LRP2) y lisenina, que fueron identificadas con una precisión del 95% y 90% de cobertura de secuencia, respectivamente, fueron los componentes principales de Venetin-1. La lisenina es una proteína de 33 kDa que se encuentra en el líquido celómico de las lombrices de tierra50. Probablemente, la lisenina es producida por celomocitos y cloragocitos libres, ya que en estas células se ha encontrado ARNm de lisenina. La lisenina se une específicamente a la esfingomielina (SM) y, cuando se une a las membranas celulares de las células diana, forma oligómeros de manera dependiente de la EM. Estas proteínas pertenecen al grupo de las toxinas formadoras de poros, que pueden ser responsables de la actividad biológica del preparado.

Se utilizó el sistema SageELF (fraccionamiento lateral electroforético) para la separación de los componentes proteicos de DVr y Venetin-1. Se utiliza para el fraccionamiento de proteínas en una matriz de gel de agarosa SDS con elución simultánea. El software controla el tiempo de fraccionamiento según la señal del marcador fluorescente agregado durante los pasos de preparación de la muestra. De esta forma, las fracciones obtenidas se dividieron según el tamaño molecular de 10 a 300 kDa. El análisis proteómico confirmó la presencia de cantidades significativas de constituyentes en todos los eluatos. En el caso de Venetin-1, la mayor parte de la fracción 9 (eluida de 8 a 10) es la forma monomérica de lisenina, actina 2 y proteína 2 relacionada con lisenina. Sin embargo, no es la única forma presente en el conjunto. preparación. Se observó una alta frecuencia de esta forma estimada por los parámetros del programa PeaksStudio (Tabla complementaria S3) en fracciones de mayor peso molecular, de las cuales se eluyeron moléculas con un peso de aproximadamente 260 kDa (fracción 1) a 100 kDa (fracción 4). Suponiendo que la masa del monómero es la masa de lisenina o LRP2 (33/34 kDa), estas pueden ser formas de trímero a octámero si son lisenina homogénea u oligómeros de LRP2 heterogéneos como una mezcla de lisenina y LRP2. Sus secuencias son muy similares (identidad 89%). Debido a la presencia de actina 2 (42 kDa) y, por ejemplo, fragmentos de ubiquitina identificados en todas las fracciones, también se supone que puede tratarse de un complejo multiproteico. El análisis del sensograma reveló diferencias entre Venetin-1 y DVr en la interacción con los lípidos. Los datos para DVr son consistentes con los informes de la literatura que señalan a las liseninas como proteínas que reconocen específicamente la esfingomielina51. En el caso de Venetin-1, se observó una disminución significativa en la unión a la esfingomielina. Puede sugerir una pérdida de la capacidad de formar los poros completos característicos de esta proteína o la formación de oligómeros no funcionales durante el calentamiento del líquido celómico crudo. Venetin-1 aún puede interactuar con SM, pero la interacción es mucho más débil. Esto también es visible en el caso del POPC, que imita las membranas de los mamíferos. DVr ejerce un efecto más débil que SM, pero la interacción en el caso de Venetin-1 es aún más débil. La identificación de proteínas de la fracción de recuperación reveló que la proteína 2 relacionada con la lisenina es una proteína fijadora de lípidos para ambas preparaciones analizadas. LRP-2 exhibe un 89% de identidad y un 94% de similitud con la secuencia de lisenina, y los datos de la literatura indican que LRP se une a SM e induce la hemólisis de los glóbulos rojos, así como de la lisenina51. Estructuralmente, comparten supuestos sitios de N-glicosilación y N-miristoilación. Los resultados muestran que la interacción de Venetin-1 con los lípidos se basa en LPR2 pero no en lisenina.

Venetin-1 perdió su actividad formadora de poros o se produjo una desactivación de la actividad formadora de poros. Esto se confirmó por la falta de capacidad hemolítica de Venetin-1 hacia los glóbulos rojos y demostró una reducción significativa de la toxicidad de Venetin-1 contra células sanas y la ausencia de hemólisis de RBC, en comparación con la preparación de DVr. La fracción DVr degradó los glóbulos rojos, mientras que su incubación con Venetin-1 no alteró estas células y no provocó la liberación de su contenido (datos no mostrados en el manuscrito). Por tanto, la interacción de formas monoméricas u oligoméricas con la superficie de la membrana sin formación de poros ni perforación de la membrana puede ser análoga en las células cancerosas. El proceso de formación de poros consta de tres pasos principales en contacto con la membrana: unión de monómeros solubles a la membrana, ensamblaje/oligomerización e incorporación completa de la forma de poro en la membrana lipídica52,53. Venetin-1 une monómeros o posiblemente oligómeros solubles a la membrana, pero los otros dos pasos parecen estar de alguna manera inhibidos.

Según el estado actual de los conocimientos médicos, todavía existe la necesidad de desarrollar nuevos fármacos que, solos o en sinergia con otros fármacos, actúen eficazmente contra el cáncer de pulmón de células no pequeñas. El cáncer de pulmón es una de las neoplasias de muy mal pronóstico ya que muchas veces se diagnostica demasiado tarde. La base del tratamiento de la mayoría de los cánceres es la terapia combinada, es decir, el uso de técnicas quirúrgicas, radioterapia y quimioterapia. El tipo de terapia depende del estadio del tumor y de la eficacia general del paciente. Durante una enfermedad oncológica y quimioterapia, el paciente puede desarrollar una infección por hongos como una complicación grave. En este caso, es muy importante conocer tanto la actividad de los citostáticos anticancerígenos como sus interacciones con los medicamentos antimicóticos. Los agentes quimioterapéuticos utilizados en oncología con propiedades antifúngicas pertenecen a diferentes grupos de fármacos citostáticos. Estos incluyen antimetabolitos derivados del platino, inhibidores de la ADN topoisomerasa y moduladores del receptor de estrógeno. Venetin-1, descrita previamente como una fracción de proteína-polisacárido, mostró una actividad antifúngica eficaz contra C. albicans sin endotoxicidad ni citotoxicidad para las células de la piel humana normal54.

Además de la actividad antitumoral contra las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas A54929,55, la fracción tiene un efecto citotóxico sobre las células de cáncer de colon56,57. Además, se ha demostrado que Venetin-1 activa los macrófagos humanos in vitro y provoca la secreción de citoquinas proinflamatorias (proteínas mensajeras): interleucina 6 (IL-6) e interleucina 1β (IL-1β) por parte de estas células. La invención fue patentada por la Oficina de Patentes polaca58. Venetin-1 se puede utilizar como componente de una preparación que aumenta la resistencia a las infecciones (p. ej., un fármaco inmunoestimulante) o mejora localmente la respuesta inmunitaria (p. ej., como adyuvante añadido a vacunas bacterianas o virales). Dado que los estudios han demostrado que Venetin-1 exhibe actividad antitumoral directa, el efecto inmunoestimulador mostrado sugiere la posibilidad de utilizar Venetin-1 en pacientes con cáncer para restaurar el funcionamiento adecuado del sistema inmunológico y combatir el cáncer o para complementar la inmunodeficiencia después de la quimioterapia.

Nuestro equipo de investigación lleva más de 10 años buscando un factor activo con actividad antimicrobiana y antitumoral en la lombriz de tierra D. veneta. En una primera etapa, estos estudios dieron como resultado el aislamiento de la bacteria simbiótica Raoultella ornithinolytica del tracto gastrointestinal de esta especie. Los metabolitos extracelulares de esta bacteria producen compuestos antibacterianos, antifúngicos y anticancerígenos59,60,61,62,63. Es necesaria la separación realizada mediante métodos cromatográficos para aislar el agente activo. Era difícil obtener una cantidad suficiente de la sustancia problema y el alto costo de la separación era otra limitación.

El siguiente paso fue intentar aislar el compuesto activo del líquido celómico. Esta etapa de la investigación tuvo éxito y, con métodos baratos, se obtuvo una gran cantidad de sustancia activa. Se aplicó separación por diálisis después de la incubación a temperatura elevada para eliminar la citotoxicidad. En este caso, la única limitación es el número de personas que se pueden ajustar libremente.

El método de adquisición de Venetin-1 es económico, rápido de realizar en cualquier momento y apto para uso comercial. Actualmente, hemos obtenido el permiso del comité de bioética para realizar investigaciones en un modelo de ratón, y en un futuro próximo se determinará la dosis que estimulará eficazmente el sistema inmunológico del animal. El preparado se administrará por vía intraperitoneal mediante inyección, ya que parece ser la mejor forma de evitar la pérdida del preparado y mantener la dosis eficaz. Después de determinar las propiedades inmunomoduladoras, se inyectará Venetin-1 a animales con cáncer de pulmón para determinar el efecto inhibidor.

El efecto anticancerígeno de las nanopartículas activas de D. veneta en las células de cáncer de pulmón A549, confirmado por la presente investigación, puede permitir el uso de un fármaco seguro y eficaz para el cáncer de pulmón. El desarrollo de un fármaco de este tipo supondría un gran avance en la terapia de esta enfermedad.

Las lombrices de tierra Dendrobaena veneta se cultivaron en condiciones de laboratorio en el Departamento de Inmunobiología de la Universidad Maria Curie-Skłodowska (Lublin, Polonia). Los invertebrados se mantuvieron en contenedores de 3 L llenos de tierra de compost a una temperatura de 20 °C en completa oscuridad. Las lombrices fueron alimentadas con verduras hervidas y hojas de té verde. La dieta se enriqueció con lignina celulosa, necesaria para producir capullos.

Las lombrices adultas se mantuvieron en lignina húmeda durante 24 h para limpiar el intestino. Luego, se recogió el líquido celómico (CF) de grupos de 10 individuos de lombrices mediante electroestimulación suave (4,5 V). La CF se recogió en NaCl al 0,9% y se centrifugó a 2500 xg durante 10 minutos a 4 °C para eliminar los celomocitos. Esto produjo un sobrenadante libre de células, que se esterilizó mediante filtración a través de filtros Millipore con un tamaño de poro de 0,22 µm. La CF libre de células se incubó durante 10 minutos a 70 °C para eliminar las propiedades citotóxicas. Luego, se transfirió a una bolsa de membrana de celulosa con un límite de 12 a 14 kDa. Las muestras se dializaron en agua durante 24 h a 4 °C. Después de la diálisis, se liofilizó Venetin-1. La preparación se almacenó a -20ºC. La concentración de proteínas se estimó en las muestras liofilizadas mediante el método de Bradford (Bio-Rad, EE. UU.)64. Para los análisis proteómicos se utilizó líquido celómico no calentado y no dializado (líquido celómico crudo, DVr).

Se cultivaron células epiteliales bronquiales humanas (BEAS-2B) y células epiteliales de adenocarcinoma de pulmón (células A549) en placas de cultivo de tejido de poliestireno de 100 mm en medio RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen, EE. UU.) que contenía FBS al 8 % (Gibco, Invitrogen, EE. UU.) y 5% de penicilina/estreptomicina (Gibco, Invitrogen, EE. UU.) en una incubadora humidificada a 37 °C, 5% de CO2 y 95% de aire. Las células se pasaron de forma rutinaria mediante tripsinización y se subcultivaron a una densidad de siembra inicial de 2 × 105 durante 72 h. Las células BEAS-2B fueron proporcionadas para la investigación por la Dra. Dorota Ścieglińska del Centro Oncológico Conmemorativo Maria Skłodowska-Curie y el Instituto de Oncología (Gliwice, Polonia). Las células A549 proceden de un cultivo celular de la Universidad de Medicina de Lublin (Polonia).

Se utilizó el ensayo de metiltiazol tetrazolio (MTT) para determinar la citotoxicidad de Venetin-1 hacia las células de cáncer de pulmón BEAS-2B y A549. Al principio, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 células/pocillo y se dejaron adherir a 37 °C en una incubadora de CO2 durante 24 h. Al día siguiente, el medio se reemplazó por uno nuevo suplementado con varias concentraciones de Venetin-1: 15,6, 31,3, 62,5, 125, 250 y 500 µg/ml. Cada placa de 96 pocillos se configuró con grupos de control (solo células) y de ajuste cero (solo medio). El ensayo se realizó por triplicado. Después de 24, 48 y 72 h, el medio de cultivo se reemplazó por uno nuevo y las células se incubaron con 20 µL de solución de trabajo de MTT (Invitrogen, CA USA) (5 mg/µL) a 37 °C durante 4 h. . Luego se eliminó el sobrenadante y los cristales de formazán de color púrpura se solubilizaron en 100 µl/pocillo de dimetilsulfóxido (DMSO) seguido de incubación (1 h). La absorbancia de la solución de formazán se midió a 550 nm con un lector de placas Victor 1420 contador multietiquetas (PerkinElmer, Inc. Waltham, MA, EE. UU.). El porcentaje de viabilidad celular se calculó utilizando la siguiente fórmula: [Viabilidad celular (%) = (DO del grupo experimental - DO del grupo de ajuste cero)/(OD del grupo de control - DO del grupo de ajuste cero) × 100%. Relación de inhibición celular (%) = 1 - viabilidad celular (%)]. Cada experimento fue repetido tres veces.

Para evaluar la apoptosis celular, las células A549 se sembraron en placas de microtitulación de 6 pocillos a una densidad de 2 x 105 células/ml y se cultivaron durante 24 h. A continuación, el medio de cultivo se reemplazó por uno nuevo (células de control) o las células se expusieron a 125 µg/ml de Venetin-1 durante 72 h. Para determinar el porcentaje de células dentro de la población que estaban experimentando activamente apoptosis, se utilizó un kit de detección de apoptosis eBioscience™ Anexina V-FITC (Invitrogen, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células recolectadas (~ 5 x 105 / ml) se resuspendieron en 200 µl de tampón de unión (1x) y se mezclaron 195 µl de la suspensión celular con 5 µl de anexina V-FITC después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron en 200 µl de tampón de unión (1x), se resuspendieron en 190 µl de tampón de unión (1x) y se tiñeron con 10 µl de yoduro de propidio (PI) (20 µg/ml). Después de una incubación de 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, las células se analizaron en un citómetro de flujo Guava easyCyte (Merck, Alemania). Las células se analizaron utilizando el software InCyte™ de Merck Millipore. Se analizaron 10.000 eventos para cada muestra y los resultados se expresaron como porcentaje de células en cada categoría. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes.

La progresión del ciclo celular se determinó mediante PI. Las células A549 se prepararon como se describió anteriormente para la evaluación de la apoptosis celular. Después de 72 h, las células se recogieron, se lavaron con PBS y, después de la centrifugación (300 g, 6 min, 4 °C), se fijaron con etanol al 70 % enfriado con hielo a 4 °C durante la noche. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS, se ajustaron a ~ 1 × 106 células y se tiñeron con solución de tinción FxCycle™ PI/RNase (Thermo Fisher, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante (15–30 min a 37 °C). . Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo Guava easyCyte (Merck, Alemania). Se adquirieron 10.000 eventos dentro de esta puerta por muestra.

El estudio involucró cultivos de células BEAS-2B normales y células de cáncer de pulmón A549. Los cultivos se llevaron a cabo en condiciones estándar (37 °C, 5% de CO2 y 90% de humedad), tanto sin como con la adición de Venetin-1. Se utilizaron kits ELISA CASP humanos para determinar la concentración de caspasas (FineTest, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd., China). La concentración de caspasa se determinó mediante ELISA de acuerdo con el manual del fabricante. Los valores de absorbancia se leyeron a 450 nm utilizando un lector de microplacas (BioRad, EE. UU.).

Se tomaron imágenes de las células cancerosas A549, tanto de control como incubadas con Venetin-1 durante 72 h (en concentraciones de 62,5 y 125 µg/ml), utilizando un microscopio Zeiss Axiovert 40CFL (Carl Zeiss, Alemania). Los cambios en su estructura también se documentaron con la función DIC (contraste de interferencia diferencial). La morfología de las células se visualizó con un aumento de 60 × utilizando un microscopio Olympus BX61 (Olympus Corporation, Japón).

Los cambios en la morfología de las células tumorales A549 características de la apoptosis se evaluaron mediante microscopía de fluorescencia utilizando una mezcla de fluorocromo Hoechst 33342 y PI (Sigma, Alemania). Se tomaron imágenes de las células de control y tratadas con Venetin-1 con un microscopio Zeiss LSM 5 Pascal (Carl Zeiss, Alemania) a longitudes de onda de emisión de ~ 460 nm y> 575 nm, respectivamente. Se añadió la mezcla de tinción a una concentración de 2,5 µl/ml al cultivo celular y las preparaciones se incubaron durante 5 minutos a 37 °C en la oscuridad. La apoptosis se evidenció por la fluorescencia azul brillante de los núcleos de células intactas o fragmentadas; las células con núcleos rosados ​​se identificaron como necróticas.

Después de la incubación con Venetin-1, se observaron mediante SEM las células A549 del carcinoma de pulmón no pequeño. Primero, se fijaron con glutaraldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0. Posteriormente, las células se montaron en portaobjetos y se tiñeron con una solución de OsO4 al 1% durante 1 h, seguido de deshidratación en una serie de soluciones de acetona (15%, 30%, 50%, 70%, 100%). Las preparaciones se secaron en un desecador usando gel de sílice durante 24 h y se bañaron en oro usando un recubridor K550X (Quorum Technologies, Reino Unido). Las células fijadas se analizaron utilizando un microscopio electrónico de barrido Tescan Vega 3 (Tescan, República Checa).

La estructura de Venetin-1 se observó y documentó con un microscopio electrónico de barrido Quanta 3D FEG (FEI, Japón). Para las observaciones microscópicas se utilizó una preparación liofilizada, que no había sido sometida a la deshidratación habitual ni a la pulverización catódica de oro. Este procedimiento permitió visualizar la sustancia activa en su forma natural.

AFM analizó la superficie de las células cancerosas de control y las células tratadas con Venetin-1. Las mediciones se realizaron utilizando un microscopio AFM NanoScope V operado en el modo de mapeo nanomecánico cuantitativo PeakForce con MultiMode 8 (Bruker, Veeco Instruments Inc.). Estaba equipado con el software NanoScope 8.15. El módulo de elasticidad local se determinó utilizando el módulo de Derjaguin-Muller-Toporov (DMT). La tasa de resorte nominal de la sonda RTESPA (Bruker, EE. UU.) (punta de silicona sobre una palanca de nitruro) fue de 40 N/m. Se determinó el módulo de Young para un área seleccionada de la superficie de la célula A549. Las muestras se prepararon como se describe para SEM. El módulo de Young se determinó para 20 campos en cada muestra (áreas oscuras de baja rigidez y áreas brillantes de alta rigidez). Los datos fueron analizados estadísticamente.

La separación de proteínas de Venetin-1 y líquido celómico crudo (DVr) se llevó a cabo con el desarrollo del sistema automático SageElf (Sage Science, Beverly, MA, EE. UU.) en un casete de gel de SDS-Agarosa al 3% (ELP3010). Permite la separación de proteínas en el rango de 10 a 300 kDa. Todas las soluciones necesarias (tampón de carga) y el marcador se suministraron con los casetes del juego. La muestra se disolvió en una solución de carga para obtener una concentración de 200 mg de proteína en 26 ml. Luego, se agregaron a la muestra 4 ml de DTT 0,5 M y toda la mezcla se calentó durante 6 minutos a 85 °C. Después de enfriar, se agregaron a la muestra 10 ml de la solución de carga con Marcador fluorescente-03 y se mezcló la muestra. Las proteínas así preparadas se introdujeron en un casete de SDS-Agarosa al 3%. La separación (modo basado en tamaño) consistió en la elución automática de proteínas del gel durante 1 h 20 min y luego 30 min. El sistema fue controlado por la versión 1.08 del software SageElf. Produjo 12 fracciones de la preparación, que luego se digirieron utilizando un procedimiento FASP estándar y tripsina (Trypsin Gold, Promega)27,65. Las fracciones obtenidas de dos ejecuciones se combinaron para un procedimiento FASP. La limpieza final se llevó a cabo según el procedimiento Stage Tips66.

El registro del espectro se realizó en un espectrómetro de masas TripleTOF 5600+ (Sciex Framingham, MA, EE. UU.) conectado a un sistema de cromatografía, el sistema Ekspert MicroLC 200 Plus (Eksigent, Redwood City, CA, EE. UU.). Todas las separaciones cromatográficas se realizaron en la columna ChromXP C18CL (3 µm, 120 Å, 150 × 0,3 mm). Para cada muestra, el gradiente cromatográfico para cada ejecución de MS fue de 11 a 42,5% B (disolvente A: solución acuosa al 0%, ácido fórmico al 0,1%; disolvente B: acetonitrilo al 100%, ácido fórmico al 0,1%) durante 60 minutos. Todo el sistema fue controlado por el software SCIEX Analyst TF 1.7.1. Las mediciones de la biblioteca espectral se adquirieron en el modo de adquisición dependiente de datos (DDA). Cada ciclo del método DDA aplicado comprendió la acumulación de espectros de precursores en 100 ms en el rango de 400 a 1200 m/z, seguido de la acumulación de los espectros de iones producto de los 20 precursores principales en 50 ms en el rango de 100 a 1800 m/z, lo que dio como resultado en un tiempo de ciclo total de 1,15 s. Los iones precursores previamente fragmentados fueron excluidos dinámicamente.

Se utilizó el software PeaksStudio XPRO (Bioinfor, Canadá) para la búsqueda en la base de datos. La identificación de proteínas se llevó a cabo con base en la base de datos Annelida revisada (04.05.2022, Uniprot) con los siguientes parámetros: carga del filtro 2–8, tolerancia al error para la masa precursora: 25 ppm, tolerancia a iones de fragmentos 0,5, escisiones máximas perdidas por péptido: tres modificaciones fijas: carbamidometilación, variables: oxidación de met, 1 % de FDR para péptidos y proteínas. Los análisis finales se realizaron en base al resultado del archivo Spider. Los datos obtenidos se depositaron en el repositorio de Pride67 bajo el identificador.

Para los experimentos de SPR, se prepararon soluciones madre de liposomas de esfingomielina (SM) y 1-palmitoil-2-deoilphpsfatidilcolina (POPC) 3 mM molar. La solución de liposomas se preparó como se describió anteriormente68. Brevemente, se suspendieron polvo liofilizado de POPC (Avanti Polar Lipids, EE. UU.) y esfingomielina (huevo de gallina; Avanti Polar Lipids, EE. UU.) en tampón PBS (Sigma Aldrich, EE. UU.). La suspensión de fosfolípidos se sometió a 10 ciclos de incubación que implicaron una incubación de 30 minutos en un baño de ultrasonido con calentamiento (333 K) y una incubación de 30 minutos a 277 K. A continuación, se realizó la extrusión utilizando un Avanti Mini Extruder (Avanti Polar Lipids, EE. UU.) con una membrana de poro de 0,1 µm. Este procedimiento, es decir, pasar la solución lipídica a través del extrusor, se repitió once veces. Una vez completado el procedimiento de extrusión, la muestra estaba lista para su uso.

La unión de los lípidos esfingomielina (SM) y 1-palmitoil-2-deoilphpsfatidilcolina (POPC) se realizó en el sensor L1 (Cytiva, EE. UU.) utilizando el instrumento Biacore T200 (Cytiva, EE. UU.). La interacción de las proteínas se analizó tras la inmovilización de los lípidos (SM o POPC) en la superficie del chip sensor L1 como se describe en el manual del fabricante. SM se inmovilizó al nivel de respuesta de 3659,96 RU (± 415,45 RU) y POPC se inmovilizó al nivel de respuesta de 4995,67 RU (± 570,47 RU). Luego, después de bloquear el sensor con una solución de albúmina de 0,5 mg/ml, se empleó el protocolo estándar del fabricante "Inyección y recuperación". Los extractos de proteínas se pasaron sobre la superficie del chip sensor con lípidos inmovilizados que permitieron la unión a las proteínas. A continuación, después de una incubación de 30 s con TFA al 0,5 %, las proteínas unidas se recuperaron en 50 µl de NH4HCO3 50 mM. Luego, las muestras recuperadas de al menos dos celdas de flujo se analizaron con MS. Después de todos los análisis, el espectro de respuesta de referencia de fondo se restó del espectro de respuesta experimental y los resultados se presentaron en sensogramas.

Las fracciones recogidas del experimento SPR que contenían proteínas unidas a los lípidos analizados se sometieron a digestión clásica en una solución. Antes de la adición de tripsina, las muestras se trataron con una solución de DTT 50 mM (45 min, 56 °C), seguido de IAA (45 min en la oscuridad). La digestión con tripsina se llevó a cabo durante la noche a 37 °C. Cuando se detuvo la digestión reduciendo el pH de la solución (ácido fórmico al 1% en agua), las muestras se purificaron con StageTips y se concentraron a 30 ml. El análisis LC-MS/MS y la identificación de proteínas se llevaron a cabo de forma analógica como en el caso de las muestras de Venetin-1.

La solución de Venetin-1 con una concentración de proteína de 1 mg/ml se colocó en una cámara ultrasónica (Pol-Sonic, Polonia) durante 10 min a 40 °C. A continuación se vitrificó la suspensión acuosa sobre una malla TEM con una película de carbono perforada (Quantifoil R 2/2; Quantifoil Micro Tools GmbH, Großlöbichau, Alemania). La malla se activó previamente durante 15 s en plasma de oxígeno mediante un dispositivo Femto (Diener Electronic, Ebhausen, Alemania). Se aplicó una muestra de 3 µl a la malla. Posteriormente, se realizó la transferencia con papel de filtro y la congelación instantánea en etano líquido utilizando un soplador Vitrobot Mark IV (FEI Company, Hillsboro, Oregon, EE. UU.). Las muestras glaseadas se mantuvieron en nitrógeno líquido hasta su colocación en un soporte Cryo-TEM Gatan 626 (Gatan Inc., Pleasanton, EE. UU.). Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM) se obtuvieron utilizando un microscopio Tecnai F20 X TWIN (FEI Company, Hillsboro, Oregon, EE. UU.) equipado con un cañón de emisión de campo (FEG) que opera a un voltaje de aceleración de 200 kV. Se utilizó una cámara Eagle 4k HS (FEI Company, EE. UU.) para la grabación de imágenes y el software TIA (FEI Company, EE. UU.) para el procesamiento.

Los estudios químicos de Venetin-1 se realizaron mediante el método de espectroscopía electrónica XPS. Los análisis se realizaron en el sistema analítico multicámara Prevac UHV (Prevac, Polonia). Después de montarlas sobre el soporte de molibdeno, las muestras de Venetin 1 analizadas se desgasificaron a temperatura ambiente a un alto vacío constante de ~ 5 × 10–8 mbar en la cerradura de carga del sistema UHV. El análisis XPS se realizó después de introducir la muestra en la cámara analítica del sistema UHV. Una fuente de radiación monocromática AlKα sirvió como fuente de excitación de fotoelectrones. Los fotoelectrones fueron excitados por radiación de rayos X con una línea característica AlKα y energía de 1486,7 eV generada por una lámpara VG Scienta SAX 100 con un ánodo de aluminio junto con un monocromador VG Scienta XM 780.

Los espectros de estudio se realizaron en una amplia gama de energías de enlace, utilizando los siguientes parámetros del analizador: modo de funcionamiento: barrido, energía de transición de 200 eV, rango medido de energía de enlace de fotoelectrones de 0 a 1200 eV, paso de medición de 0,5 eV, tiempo de recolección en un solo paso: 0,2 s, número de iteraciones: 4.

Después de realizar el estudio del espectro, también se crearon espectros en un rango estrecho de energías de enlace para carbono, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre. Las pruebas se realizaron con los siguientes parámetros del analizador: modo de funcionamiento: barrido, energía de transición de 50 eV, paso de medición: 0,1 eV, tiempo de recolección en un solo paso: 0,667 s.

Para los cálculos cuantitativos, los espectros obtenidos se procesaron con el software Casa XPS. Los ejes X correspondientes a la energía del enlace se calibraron utilizando el pico de carbono alifático C1. Se supuso que la energía de enlace correspondiente a este pico era EB = 285,0 eV.

Para caracterizar el tamaño de las micropartículas de Venetin-1, realizamos un experimento DLS utilizando el instrumento Prometheus Panta (NanoTemper Technologies GmbH, Alemania). Las muestras se cargaron en ocho capilares que actuaron como réplicas donde el análisis paralelo reveló la homogeneidad de las micropartículas.

Los datos obtenidos de los análisis proteómicos se han depositado en el repositorio PRIDE y están disponibles con el número de acceso PXD034132.

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Descargar referencias

El análisis químico del compuesto activo contó con el apoyo del Proyecto del Centro Nacional de Ciencias de Polonia [2020/37/B/NZ7/00763]. Nos gustaría agradecer a la Dra. Dorota Ścieglińska del Centro Oncológico e Instituto de Oncología Maria Skłodowska-Curie Memorial (Gliwice, Polonia) por proporcionar las células BEAS-2B.

Facultad Intercolegial de Biotecnología de la Universidad de Gdańsk y Universidad de Medicina de Gdańsk, Gdańsk, Polonia

Magda Rybicka, Paulina Czaplewska, Katarzyna Węgrzyn, Agata Szpiech y Natalia Musiał

Departamento de Biología y Genética, Universidad Médica de Lublin, Lublin, Polonia

Jolanta Rzymowska

Laboratorio Analítico, Instituto de Ciencias Químicas, Facultad de Química, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Weronika Sofińska-Chmiel

Departamento de Inmunobiología, Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Sylwia Wójcik-Mieszawska y Marta J. Fiołka

Departamento de Biología Celular, Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Kinga Lewtak

Facultad de Química, Universidad de Gdańsk, Gdańsk, Polonia

Przemysław Jurczak

Centro Malopolska de Biotecnología, Universidad Jagellónica, Cracovia, Polonia

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MF obtuvo el complejo activo de Venetin-1, realizó análisis Cryo-TEM y SEM, preparaciones de AFM, análisis de apoptosis (Fig.5), coordinación de la investigación y escribió el texto principal del manuscrito; SWM escribió la introducción e hizo las Figs.7, 4 y análisis estadístico; JR realizó análisis de caspasa y microscopía óptica de células cancerosas (Fig. 55 a); KL hizo las figuras 4 y 6 y la literatura; RM realizó análisis de citometría de flujo; Análisis de resultados por PC, preparación de mediciones de SPR, preparación del manuscrito; KW realizó mediciones de SPR y recopiló datos de SPR; PJ hizo preparación de liposomas; AS y NM realizaron la separación de SageElf, la digestión con FASP, la preparación y el análisis del método LC-MS/MS, WSC realizó el análisis de XPS y JN preparó el análisis de Pantha.

Correspondencia a Paulina Czaplewska o Marta J. Fiołka.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Rybicka, M., Czaplewska, P., Rzymowska, J. et al. Nueva nanopartícula Venetin-1 procedente del líquido celómico de lombriz de tierra como agente prometedor para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas. Informe científico 12, 18497 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21665-8

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Recibido: 17 de mayo de 2022

Aceptado: 29 de septiembre de 2022

Publicado: 02 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21665-8

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