Receptor para el final de la glicación avanzada

Aug 16, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 5, número de artículo: 824 (2022) Citar este artículo

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En los mamíferos, tanto los fagocitos profesionales como los no profesionales (NPP) pueden realizar la fagocitosis. Sin embargo, las NPP fagocitan objetivos limitados y, por lo tanto, el mecanismo aún no está claro. Encontramos que las NPP internalizan eficientemente las esporas de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Los análisis de este fenómeno revelan que fragmentos de ARN derivados de especies de ARN citosólico están adheridos a la pared de las esporas y estos fragmentos sirven como ligandos para inducir la internalización de las esporas. Además, mostramos que un receptor multiligando, RAGE (receptor para productos finales de glicación avanzada), media la fagocitosis en las NPP. La fagocitosis mediada por RAGE no es inducida únicamente por esporas, sino que es un mecanismo intrínseco mediante el cual las NPP internalizan macromoléculas que contienen ligandos RAGE. De hecho, las partículas artificiales marcadas con polinucleótidos, HMGB1 o histonas (pero no con albúmina sérica bovina) se internalizan en las NPP. Nuestros hallazgos proporcionan información sobre las bases moleculares de la fagocitosis por parte de las NPP, un proceso mediante el cual se selecciona una variedad de macromoléculas para su internalización.

Diversas células eucariotas pueden fagocitar partículas grandes (≥0,5 µm de diámetro) e internalizarlas mediante un proceso endocítico llamado fagocitosis1. En los mamíferos, una clase de células ha evolucionado para realizar la fagocitosis; estas células, incluidos los macrófagos, los neutrófilos y las células dendríticas, se denominan fagocitos profesionales1. Además de los fagocitos profesionales, la fagocitosis se produce en muchas otras células, como las células epiteliales, los fibroblastos y los tumores; estas células se denominan fagocitos no profesionales (NPP)2,3,4,5. En comparación con los fagocitos profesionales, la gama de macromoléculas internalizadas por las NPP es limitada3. Sin embargo, estudios con ratones con deficiencia de macrófagos han demostrado la redundancia funcional entre NPP y macrófagos, al menos para la eliminación de células apoptóticas6,7. Sin embargo, se han realizado muy pocos estudios para explorar las funciones fisiológicas de la fagocitosis por NPP, en parte porque el mecanismo molecular no se comprende bien.

Las células pueden internalizar partículas grandes mediante fagocitosis o macropinocitosis1. La macropinocitosis es un proceso mediante el cual moléculas extracelulares se internalizan aleatoriamente en las células. Por el contrario, la fagocitosis es un proceso endocítico inducido por receptores y ligandos1. Por lo tanto, en este proceso, las partículas descoladas con ligandos específicos son el objetivo de la internalización. En los fagocitos profesionales se encuentran varios receptores fagocíticos, como los receptores Fcγ, las integrinas y los receptores carroñeros8. En general, los receptores fagocíticos se activan uniéndose a sus ligandos específicos, lo que conduce a la reorganización del citoesqueleto de actina para deformar la membrana plasmática. Cuando la membrana plasmática se extiende alrededor de las partículas diana, los receptores fagocíticos se unen secuencialmente a su ligando presentado en las partículas diana. Finalmente, las partículas diana son engullidas por la membrana plasmática y internalizadas en las células fagocíticas1. Las partículas internalizadas están compartimentadas en una estructura unida a una membrana denominada fagosoma, que madura hasta convertirse en fagolisosomas mediante fusión con lisosomas9.

Uno de los objetivos de nuestro estudio es utilizar esporas de la levadura Saccharomyces cerevisiae como micropartículas10. Las esporas de levadura son una forma celular latente y resistente al estrés que se genera cuando se incuban células diploides en condiciones de inanición11. La formación de esporas ocurre dentro de las células madre, donde cuatro núcleos producidos mediante meiosis están encerrados individualmente por la membrana plasmática de las esporas y la pared de las esporas. A través de este proceso, las células madre se convierten en ascas, incluidas cuatro esporas. A diferencia de las células vegetativas, las esporas tienen capas de ditirosina y quitosano en el exterior de su pared celular (esporas)12. El quitosano se encuentra a menudo en las paredes celulares de los hongos, pero la capa de ditirosina es una estructura única que se encuentra en la pared de esporas de S. cerevisiae13,14. El constituyente principal de la capa de ditirosina es la ll-bisformil ditirosina. Si bien la estructura detallada de esta capa aún no está clara, las moléculas de ll-bisformil ditirosina presumiblemente están entrecruzadas para producir una macromolécula que está unida covalentemente a la capa de quitosano15. Las capas de ditirosina y quitosano hacen que las esporas sean resistentes al estrés ambiental11.

Durante el curso de nuestro estudio, realizamos un experimento para incubar esporas con células de mamíferos cultivadas; En este experimento, encontramos que las esporas se fagocitan en las NPP. Un análisis más detallado de este fenómeno reveló que la internalización de las esporas por las NPP está mediada por receptores para productos finales de glicación avanzada (RAGE). RAGE es un miembro de la superfamilia de receptores de inmunoglobulinas y originalmente se identificó como un receptor para productos finales de glicación avanzada16,17. Sin embargo, ahora se sabe que RAGE reconoce múltiples ligandos, incluidos polinucleótidos, fosfatidilserina (PS) y caja del grupo 1 de alta movilidad (HMGB1)18,19,20. La mayoría de los ligandos de RAGE se conocen como patrones moleculares asociados a daños (DAMP), y se sabe que la activación de la vía de señalización de RAGE induce inflamación21,22. RAGE puede internalizar sus ligandos a través de la vía endocítica18,23. Además, RAGE puede reconocer PS y participa en la fagocitosis de células apoptóticas (eferocitosis) en macrófagos19. Sin embargo, se desconoce su papel en la fagocitosis de las NPP. Las esporas se fagocitan en las NPP porque un ligando RAGE, el ARN, está adherido a la pared de las esporas. Además de las esporas, en las NPP se fagocitan partículas decoradas con ligandos RAGE. Nuestros resultados demuestran que varias macromoléculas pueden internalizarse en las NPP mediante procesos fagocíticos mediados por RAGE.

Las esporas de levadura se producen en el ascus (Figura complementaria 1a). Al romper la membrana y la pared del ascal, se pueden liberar esporas de los ascos (Figura complementaria 1b). Cuando las esporas se incubaron con células HEK293T, encontramos que las esporas, pero no las células de levadura vegetativa, mostraron toxicidad para las células HEK293T (Figura complementaria 1c). A diferencia de las células vegetativas, las esporas tienen capas de ditirosina y quitosano en el exterior de la pared celular (esporas)12 (Figura complementaria 1a). Dado que las células vegetativas eran inofensivas (Figura 1c complementaria), especulamos que la toxicidad de las esporas es atribuible a la estructura única de la pared de las esporas. De acuerdo con esta hipótesis, las esporas de dit1∆, que carecen de la capa de ditirosina24 (Figura complementaria 1a), no mostraron toxicidad (Figura complementaria 1c). Cuando se observaron al microscopio las células HEK293T incubadas con esporas, nos dimos cuenta de que las esporas estaban internalizadas en las células de los mamíferos. Confirmamos que las esporas se incorporaron a los lisosomas mediante tinción con una sonda acidotrópica LysoTracker (Fig. 1a, b). LysoTracker no tiñó las esporas en las condiciones utilizadas en nuestro ensayo de internalización (Figura complementaria 1d). En comparación con las esporas de tipo salvaje, los niveles de internalización de las células vegetativas y las esporas dit1∆ por las células HEK293T fueron más bajos (Fig. 1c, d). Descubrimos que una fracción de las esporas se hinchó en las células HEK293T cuando se incubaron durante 12 h (Figura complementaria 1e), lo que sugiere que las esporas podrían germinar en las células cultivadas. Para evaluar si la viabilidad de las esporas está relacionada con su toxicidad, se incubaron esporas muertas por calor con células HEK293T. Los niveles de internalización de esporas por parte de las células HEK293T no se alteraron mediante el tratamiento térmico (Figura complementaria 1f); sin embargo, las esporas muertas por calor no mostraron toxicidad (Figura complementaria 1g). Estos resultados sugieren que la citotoxicidad de las esporas es atribuible a su internalización y germinación. Dado que S. cerevisiae no es un organismo patógeno, el significado fisiológico de la toxicidad de las esporas no está claro. Sin embargo, nos interesa el fenómeno de la internalización de las esporas en células cultivadas; por lo tanto, se analizó más a fondo la base del mecanismo de internalización.

a Se obtuvieron imágenes representativas de células HEK293T con esporas internalizadas que expresan GFP con contraste de interferencia diferencial (DIC) o microscopía de fluorescencia (esporas y lisosomas). Las células HEK293T se incubaron con esporas a 3,6 x 107 esporas/4–6 x 105 células HEK293T/ml. Los lisosomas se tiñeron con LysoTracker Red. Barra de escala, 10 µm. b Número de esporas internalizadas por célula HEK293T (círculos negros) y porcentajes de células HEK293T con esporas internalizadas (triángulos rojos). Se incubaron células HEK293T durante 1 h con diversas cantidades de esporas en DMEM. c Internalización de células de levadura en centrales nucleares. Se incubaron esporas o células vegetativas (vegetativas) con células HEK293T a 1,2 x 107 células de levadura/4–6 x 105 células HEK293T/ml; o con células HEK293, células uroepiteliales humanas (HUC) o células HeLa a 1,2 × 107 células de levadura/3,4–4,6 × 105 células de mamífero/ml. d Internalización de esporas de tipo salvaje (wt) o dit1∆ en células HEK293T. e Internalización de esporas en células HEK293T tratadas con o sin (control) inhibidor de la polimerización de actina latrunculina A (LAT-A), inhibidor de la tirosina quinasa del bazo piceatannol (PT) o inhibidor de la fosfatidilinositol-3 quinasa wortmannin (WTM). f Efecto de la presencia (+) o ausencia (-) de suero de ternera fetal (FCS) al 10% sobre la internalización de esporas en células HEK293T. Los datos se presentaron como la media ± SEM (b – f). La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Student no apareadas de dos colas. norte = 3 (b – d, f), norte = 4 (e). ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns, no significativo (P ≥ 0,05).

Las esporas se pueden internalizar en varias líneas celulares, incluidas HEK293, HeLa y células uroepiteliales humanas (Fig. 1c). Entre las líneas celulares que probamos, las células HEK293T internalizaron las esporas de manera más eficiente (Fig. 1c); por tanto, esta línea celular se utilizó para estudios posteriores. Dado que las esporas tienen ~ 3 µm de diámetro (Figura 1b complementaria), es probable que se internalicen mediante fagocitosis o macropinocitosis. Debido a que las esporas están destinadas a la internalización como se describe a continuación, planteamos la hipótesis de que las esporas se internalizan mediante fagocitosis. Dado que todas las líneas celulares utilizadas en el ensayo de internalización derivaban de tejidos epiteliales, estos resultados sugirieron que las esporas inducen la fagocitosis en las NPP. De manera similar a la fagocitosis mediada por el receptor Fcγ en macrófagos, la internalización de esporas en células HEK293T fue inhibida por inhibidores de la polimerización de actina25, tirosina quinasa del bazo (SYK)26 y fosfatidilinositol-3 quinasa (PI3K)27 (Fig. 1e). Además del ensayo de fagocitosis basado en microscopía, el efecto inhibidor de los inhibidores en la internalización de esporas por parte de las células HEK293T se verificó con un ensayo de fagocitosis basado en clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Figura complementaria 2). La expresión de SYK en células HEK293T se confirmó mediante transferencia Western (Figura complementaria 3a). Además, encontramos que los niveles de internalización de esporas por parte de las células HEK293T disminuyeron con la eliminación de SYK (Figura complementaria 3b). En este estudio, los ensayos de fagocitosis se realizaron en medios suplementados con suero inactivado por calor. Además, las células HEK293T internalizaron esporas en ausencia de suero (Fig. 1f). Por tanto, la internalización de las esporas en las células HEK293T se produce incluso en ausencia de anticuerpos y del sistema del complemento.

Las esporas se internalizan eficientemente en las NPP, lo que sugiere que la pared de las esporas está decorada con un ligando para inducir la fagocitosis. Dado que la internalización de las esporas se inhibió mediante el lavado con una solución con alto contenido de sal (NaCl 0,6 M) (Fig. 2a), lo más probable es que el ligando esté asociado de forma no covalente con la capa más externa (capa de ditirosina) de la pared de las esporas. Dado que las esporas se forman en el citosol de la célula madre (Figura 1a complementaria), especulamos que los materiales citosólicos se adherirían a la pared de las esporas. Sorprendentemente, los niveles de internalización de esporas por parte de las células HEK293T disminuyeron con el tratamiento con RNasa pero no con el tratamiento con DNasa (Fig. 2a). De acuerdo con el resultado, se detectó ARN en el eluido de las esporas lavadas con una solución rica en sal (Fig. 2b). Los niveles de internalización de las esporas también disminuyeron con el tratamiento con proteasa (Fig. 2a). En comparación con el caso de las esporas de tipo salvaje, el lavado de las esporas de dit1∆ con una solución con alto contenido de sal liberó menores cantidades de ARN de la pared de las esporas (Fig. 2c), un resultado que se correlacionó con la observación de que los niveles de internalización de las esporas por parte de las células HEK293T disminuyeron por la mutación dit1∆ (Fig. 1d). El ensayo de fagocitosis basado en FACS también mostró que las células HEK293T que contenían esporas disminuyeron cuando las esporas se trataron con RNasa, proteasa o solución con alto contenido de sal (Figura complementaria 4).

a Internalización de esporas tratadas con los reactivos indicados en células HEK293T. b Detección de ARN unido a la pared de la espora. Los ácidos nucleicos purificados a partir del eluato de esporas con alto contenido de sal se trataron con las enzimas indicadas. Estas muestras tratadas y no tratadas (control) se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se tiñeron con un tinte de ácido nucleico fluorescente. Se utilizó como referencia un marcador de ADN de doble cadena. c Panel izquierdo: Detección de ARN unido a esporas de tipo salvaje (wt) o dit1∆. Panel derecho: cantidad de ARN eluido de 2 × 108 de esporas de tipo salvaje (wt) o dit1∆. Los datos se presentaron como media ± SEM (a, c). La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Student no apareadas de dos colas. norte = 3 (a, c). ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns no significativo (P ≥ 0,05).

La internalización de las esporas puede ser inducida por un ARN único adherido a la pared de las esporas. Así, se identificó el ARN unido a la pared de las esporas mediante secuenciación del ARN. La mayoría de los fragmentos de ARN liberados de la pared de las esporas oscilaron entre 25 y 29 nucleótidos (nt) (Figura complementaria 5a). El resultado de la secuenciación de ARN (depositado en la base de datos Sequence Read Archive, número de acceso PRJNA748575) mostró que más de la mitad de los fragmentos de ARN se derivaron de secuencias de ARNt (Figura complementaria 5b). En particular, entre los fragmentos derivados de ARNt, el 87% eran fragmentos derivados de especies de ARNtAsp (Figura complementaria 5c). Además de los fragmentos de ARNt, se encontraron fragmentos derivados de ARNr, ARN viral y ARNm (Figura complementaria 5b). Por tanto, la pared de las esporas está decorada con una variedad de secuencias de ARN citosólico.

Dado que el ARNt se encontró con mayor abundancia en el ARN unido a la pared de las esporas, analizamos si la fagocitosis por parte de las células HEK293T es inducida únicamente por el ARNt. Para ello, evaluamos la internalización de perlas de látex unidas a ARNt por células HEK293T. Se demostró que las perlas de látex que contienen grupos amina superficiales adsorben el ARNt purificado (Fig. 3a). Los niveles de internalización de perlas de látex por parte de las células HEK293T aumentaron mediante la unión del ARNt (Fig. 3b). LysoTracker no tiñó las perlas de látex en el ensayo de internalización (Figura complementaria 1d). Sin embargo, los niveles de internalización de las perlas de látex unidas a polinucleótidos fueron inferiores a los de las esporas; como se muestra en la Fig. 2a (control) y 3b (ARNt), cuando se incubaron 1,2 × 107 perlas (incubadas con ARNt a 300 µg/2 × 108 perlas/ml) o esporas con células HEK293T, sus niveles de internalización fueron 0,18 o 1,18. por células HEK293T, respectivamente. También examinamos la internalización de perlas de látex unidas a ARN derivadas de la pared de esporas (Fig. 3b) por células HEK293T. Las perlas de látex adsorbieron el ARN derivado de la pared de esporas más que el ARNt por razones desconocidas (Fig. 3a), aunque no se encontraron diferencias entre los niveles de internalización de las perlas de látex unidas a ARN derivadas de la pared de esporas y las perlas de látex unidas a ARNt (Fig. 3b). .

a Cantidades de ARN unidos a perlas de látex. Se incubaron ARN derivado de la pared de esporas (ARN de esporas) o ARNt con perlas de látex a las concentraciones indicadas y se midieron las cantidades de ARN unido a las perlas. b Internalización de perlas de látex unidas a ARN en células HEK293T. Paneles superiores: imágenes representativas de células con perlas de látex unidas a ARNt internalizadas. Barra de escala, 10 µm. Panel inferior: las perlas de látex unidas a ARN indicadas se incubaron con células HEK293T en las concentraciones indicadas. Se muestra el número medio de perlas internalizadas por célula HEK293T. Los datos se presentaron como media ± SEM. La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Student no apareadas de dos colas. n = 3. *P < 0,05; **P < 0,01; ns no significativo (P ≥ 0,05).

Al igual que las perlas de látex que contienen grupos amina superficiales, las esporas dit1∆ tienen una capa de quitosano cargada positivamente en la superficie de la pared de las esporas12 (Figura complementaria 1a). Sin embargo, las esporas de tipo salvaje podrían contener más ARN que las esporas dit1∆ (Fig. 2c), lo que sugiere la presencia de maquinaria para acomodar el ARN en la capa de ditirosina. Es probable que esta maquinaria involucre proteínas, dado que el tratamiento con proteasas resultó en una pérdida de ARN unido a la pared de las esporas (Figura complementaria 6a). La maquinaria de unión al ARN persiste en la pared de las esporas durante el lavado con alto contenido de sal. De hecho, las esporas lavadas con alto contenido de sal adsorbieron el ARN derivado de la pared de esporas (Fig. 4a). La internalización de esporas lavadas con alto contenido de sal por células HEK293T mejoró mediante la unión del ARN derivado de la pared de esporas (Fig. 4b). Los niveles de internalización de las esporas lavadas con alto contenido de sal unidas a ARN derivadas de la pared de esporas fueron mayores que los de las perlas de látex unidas a ARN derivadas de la pared de esporas; cuando el ensayo de fagocitosis se realizó con 1,2 × 107 esporas unidas a ARN derivadas de la pared de esporas (incubadas con el ARN a 40 µg/2 × 108 esporas/ml) o perlas de látex (incubadas con el ARN a 300 µg/2 × 108 perlas/ml), sus niveles de internalización fueron 0,87 o 0,22 por células HEK293T, respectivamente (Figs. 3b, 4b). Dado que las esporas lavadas con alto contenido de sal adsorbieron más polinucleótidos que las perlas de látex (Figura complementaria 6b), la eficiencia de la internalización por parte de las células HEK293T puede estar relacionada con la cantidad de polinucleótidos unidos a las partículas. Como se mencionó anteriormente, no se encontraron diferencias entre los niveles de internalización de las perlas de látex unidas a ARNt y ARNt derivadas de la pared de esporas. Esta contradicción puede atribuirse a los bajos niveles de internalización de las perlas de látex unidas a polinucleótidos (Fig. 3b).

a Cantidades de polinucleótidos unidos a esporas lavadas con alto contenido de sal. Las esporas lavadas con alto contenido de sal se incubaron con ARN derivado de la pared de esporas (ARN de esporas), ARNt o ADN1 en las concentraciones indicadas. Los polinucleótidos unidos a las esporas se eluyeron en una solución con alto contenido de sal y se midieron sus cantidades. b Internalización de esporas lavadas con alto contenido de sal unidas a polinucleótidos en células HEK293T. Las esporas lavadas con alto contenido de sal incubadas con ARN derivado de la pared de esporas (ARN de esporas), ARNt o ADN1 en las concentraciones indicadas se incubaron con células HEK293T. Se muestra el número medio de esporas internalizadas por célula HEK293T. c Internalización de esporas lavadas con alto contenido de sal (2 × 108) incubadas con (+) o sin (-) 40 µg de los polinucleótidos indicados en células HEK293T. Como control, se incubaron esporas no tratadas con células HEK293T (lavado con sal -). d Internalización de esporas en células HEK293T en presencia o ausencia (control) de los polinucleótidos indicados. Los datos se presentaron como media ± SEM. La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Student no apareadas de dos colas. Para a, b, se realizaron pruebas t de Student entre los datos de ARN derivado de la pared de esporas y ARNt o ADN1. norte = 3 (a, b, d), norte = 4 (c). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ns no significativo (P ≥ 0,05).

Además del ARN derivado de la pared de esporas, las esporas adsorbieron ARNt purificado y un fragmento de ADN monocatenario de 22 nt llamado ADN1 (Fig. 4a). DNA1 es un imitador de un fragmento de tRNAAsp que se encontró más abundantemente en el ARN unido a la pared de esporas. La cantidad de polinucleótidos unidos a esporas lavadas con alto contenido de sal disminuyó mediante el tratamiento con proteasa (Figura complementaria 6b), lo que es consistente con la hipótesis de que las proteínas están involucradas en la maquinaria de unión de polinucleótidos. La internalización de esporas lavadas con alto contenido de sal por células HEK293T mejoró mediante la unión de ARNt y ADN1 (Fig. 4b). Al igual que con las perlas de látex, el ARN derivado de la pared de esporas se unió a las esporas de manera más eficiente que otros polinucleótidos (Fig. 4a). De acuerdo con la hipótesis de que los niveles de internalización de partículas por parte de las células HEK293T eran relativos a la cantidad de polinucleótidos unidos a las partículas, las esporas que habían adsorbido ARN derivado de la pared de esporas se internalizaron de manera más eficiente que las esporas que habían adsorbido otros polinucleótidos antes de que se cancelaran sus uniones. saturado (Fig. 4b). Luego, analizamos la unión de otro fragmento de ADN monocatenario que consistía en una secuencia que no estaba relacionada con los ARNt (su secuencia se muestra en la Tabla complementaria 1); el fragmento de ADN se denominó ADN2. DNA1 y DNA2 se unieron a esporas en niveles similares (Figura complementaria 6b). En particular, dos fragmentos de ADN con secuencias distintas indujeron la internalización de esporas lavadas con alto contenido de sal en niveles comparables (Fig. 4c). Estos resultados sugieren colectivamente que los polinucleótidos sirven como ligandos para inducir la fagocitosis y que la secuencia de nucleótidos no es crítica para la inducción de la internalización por parte de células cultivadas. Las células HEK293T internalizan las esporas de manera más eficiente que las perlas de látex unidas a polinucleótidos, tal vez porque las esporas pueden contener más ligando (ARN) que las perlas de látex (Figura complementaria 6b). Para respaldar aún más esta hipótesis, un ensayo de inhibición competitiva (Fig. 4d) mostró que la adición de polinucleótidos libres inhibía la internalización de esporas por parte de las células HEK293T.

A continuación, buscamos identificar el receptor que media la internalización de esporas en células de mamíferos. Dado que lo más probable es que los polinucleótidos sean ligandos, varios receptores que se sabe que se unen a polinucleótidos18,28,29,30,31,32 se sobreexpresaron como fusiones de proteína fluorescente roja (RFP) en células HEK293 (no en células HEK293T) y se evaluaron sus efectos sobre la internalización de esporas. (Figura 5a). En este experimento se utilizaron células HEK293 porque esta línea celular mostró una eficiencia fagocítica menor que HEK293T (Fig. 1c); Especulamos que los niveles fagocíticos en HEK293 podrían mejorarse mediante la sobreexpresión del receptor. Descubrimos que los niveles de internalización de esporas se elevaron más del doble por la expresión de RAGE-RFP (Fig. 5a). Los niveles de expresión de ARNm de RAGE en células HEK293T fueron aproximadamente 1,5 veces más altos que los de las células HEK293 (Figura complementaria 7a). La internalización de esporas en células HeLa y HEK293T también mejoró mediante la sobreexpresión de RAGE (Figura complementaria 7b). De acuerdo con el papel de RAGE en la internalización de esporas, este proceso disminuyó 10 veces en las células knockout de RAGE (Fig. 5b). La pérdida de expresión de RAGE en células HEK293T RAGE KO se verificó mediante análisis de transferencia Western (Figura complementaria 7c). El resultado del análisis FACS también mostró que RAGE KO disminuyó la fagocitosis de esporas por HEK293T (Figura complementaria 7d). Además, el defecto en la internalización de esporas en las células HEK293T RAGE KO se rescató mediante la expresión de RAGE-RFP (Fig. 5b). La internalización de perlas unidas a polinucleótidos también disminuyó en las células HEK293T RAGE KO (Fig. 5c). Además de RAGE, encontramos que la internalización de esporas en células HEK293 también aumentó por la sobreexpresión del receptor tipo Toll 3 (TLR3) (Fig. 5a). Sin embargo, los niveles de internalización de esporas en las células HEK293T no se vieron alterados por la eliminación de TLR3 (Figura complementaria 7e), lo que muestra que este receptor no es necesario para la internalización de esporas o es redundante con otro receptor que proporciona la misma función. Por lo tanto, TLR3 no se considera más aquí.

a Panel izquierdo: internalización de esporas en células HEK293 que expresan las fusiones de RFP indicadas o RFP sola. Panel derecho: análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-RFP para verificar la expresión de las fusiones RFP. La actina se utiliza como control de carga. b Internalización de esporas en células HEK293T (wt) o HEK293T RAGE KO que expresan las fusiones RFP indicadas. c Internalización de perlas de látex en células HEK293T o HEK293T RAGE KO de tipo salvaje. Las perlas de látex unidas a polinucleótidos indicadas se incubaron con células HEK293T o HEK293T RAGE KO de tipo salvaje. d Panel superior: RAGE1–341-His-FLAG purificado se sometió a análisis SDS-PAGE y se tiñó con azul brillante de Coomassie. Panel inferior: cuantificación de las intensidades de fluorescencia del ARN-Cy3 precipitado con RAGE1–341-His-FLAG adherido a perlas de agarosa o perlas de agarosa desnudas (control). e Panel izquierdo: Unión de RAGE1–341-His-FLAG a perlas de látex unidas a ARNt. RAGE1–341-His-FLAG se incubó con perlas unidas a ARNt o perlas desnudas (perla), y la proteína precipitada con las perlas se detectó mediante análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-etiqueta His. Panel derecho: Cuantificación de RAGE1–341-His-FLAG precipitado con perlas unidas a ARNt o perlas desnudas (perla). Se mostraron las intensidades relativas de RAGE1–341-His-FLAG precipitadas con las perlas. La intensidad de RAGE1–341-His-FLAG precipitada con perlas desnudas se definió como 1. f El proceso de internalización de esporas en células HEK293T seguido de microscopía de lapso de tiempo. Las células HEK293T que expresaban transitoriamente RAGE-GFP se preincubaron con LysoTracker Red (lisosoma) y luego se incubaron con esporas. Se muestran imágenes representativas de una espora que se internaliza (flecha). Barra de escala, 10 µm. Los datos se presentaron como media ± SEM (a – e). La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Student no apareadas de dos colas. n = 3. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns no significativo (P ≥ 0,05).

RAGE tiene dos parches de unión de polinucleótidos, que se denominan Sitio 1 y Sitio 218. Internalización de esporas en células HEK293T RAGE KO que expresan RAGE-RFP que albergan mutaciones en cualquiera de los sitios de unión de nucleótidos (denominados RAGEmut1-RFP y RAGEmut2-RFP, respectivamente) fue menor que el observado en las células que expresan RAGE-RFP (Fig. 5b). Para analizar más a fondo la unión entre RAGE y ARN, realizamos ensayos de unión in vitro. La región extracelular de RAGE (aminoácidos 1 a 341) fusionada con FLAG y etiquetas His se expresó en células HEK293; el RAGE truncado se denominó RAGE1–341-His-FLAG. Se unió RAGE1–341-His-FLAG purificado a perlas de agarosa conjugadas con un anticuerpo anti-etiqueta FLAG y se incubó con un fragmento de ARN (un imitador de ADN1) fusionado con cianina 3 (Cy3). Como se muestra en la Fig. 5d, el fragmento de ARN está unido a la región extracelular de RAGE. Además, encontramos que RAGE1–341-His-FLAG se precipitó con perlas de látex unidas a ARNt más que con perlas de látex desnudas (Fig. 5e). Estos resultados demuestran que el ARN se une directamente a RAGE. Los pesos moleculares previstos de RAGE1–341-His-FLAG son 40,7 kDa. El RAGE1-341-His-FLAG purificado (Fig. 5d) detectado por SDS-PAGE fue mayor que el peso molecular predicho (Fig. 5d), presumiblemente porque RAGE tiene dos sitios de glicosilación ligados a N.

Para evaluar la localización de RAGE durante la internalización de las esporas, realizamos microscopía de lapso de tiempo. Este análisis mostró que la espora fue engullida por la proteína verde fluorescente (GFP) fusionada con RAGE antes de su internalización (Fig. 5f y video complementario 1). RAGE-GFP se internalizó junto con las esporas y, posteriormente, los compartimentos que contienen esporas y fusión de GFP se tiñeron con LysoTracker (Fig. 5f y video complementario 1). Los niveles de intensidades fluorescentes de RFP en ciertas áreas de las copas fagocíticas (esporas que envuelven la membrana plasmática) fueron más altos que los de las áreas adyacentes a la copa fagocítica en la membrana plasmática en las células fijas (Figura complementaria 7f, g). Este resultado sugiere que RAGE-RFP se recluta en copas fagocíticas. En conjunto, nuestros hallazgos indicaron que las esporas se internalizan mediante fagocitosis mediada por RAGE.

RAGE se expresa principalmente en el pulmón en comparación con otros órganos33,34. Para evaluar si la fagocitosis mediada por RAGE se produce in vivo, se realizó un ensayo de internalización de esporas con células epiteliales alveolares primarias de ratón tipo II (ATII). Las esporas fueron internalizadas por células ATII primarias (Fig. 6a, b). La internalización de esporas en células ATII fue inhibida por reactivos o mutaciones que comprometieron de manera similar la internalización de esporas en células HEK293T (Fig. 6b-d). Para determinar si se requiere Rage (el homólogo de ratón) para la internalización de esporas en células ATII, se realizó la eliminación de Rage mediada por interferencia de ARN (ARNi). El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (qRT-PCR) mostró que los niveles de la transcripción de Rage de ratón disminuyeron mediante la transfección de células ATII con pequeños ARN de interferencia (ARNip) dirigidos a Rage (Fig. 6e, panel izquierdo). En consecuencia, los niveles de internalización de esporas por parte de las células de ratón disminuyeron en las células de eliminación de Rage en relación con las células ATII de control (Fig. 6e, panel derecho). Este resultado sugiere que la fagocitosis mediada por RAGE ocurre en varias NPP.

a Imágenes representativas de células ATII con esporas internalizadas. Las imágenes se obtuvieron con contraste de interferencia diferencial (DIC) o microscopía de fluorescencia (esporas y lisosomas). Los lisosomas se tiñeron con LysoTracker Red. Barra de escala, 20 µm. b Internalización de esporas de tipo salvaje (wt) o dit1∆ en células ATII. Se incubaron esporas de tipo salvaje (wt) o dit1∆ sin ningún tratamiento (-), esporas de tipo salvaje tratadas con proteasa o RNasa A (RNasa) con células ATII. c Internalización de esporas en células ATII tratadas con o sin (control) piceatannol (PT) o wortmannin (WTM). d Internalización de esporas en células ATII en presencia o ausencia (control) de DNA1. e Panel izquierdo: niveles de ARNm de Rage en células ATII primarias de ratón transfectadas con dos ARNip dirigidos a Rage (ARNip1 y ARNip2) o un control de ARNip no dirigido (nc). Se muestran las proporciones de los niveles de ARNm de Rage en células transfectadas con ARNip dirigidos a Rage con respecto a aquellos en células transfectadas con nc. Panel derecho: internalización de esporas en células ATII transfectadas con Rage knockdown y nc. Los datos se presentaron como media ± SEM (b – e). La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Student no apareadas de dos colas. n = 3. **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.

Dado que RAGE es un receptor multiligando, examinamos si la fagocitosis mediada por RAGE es inducida por otro ligando, HMGB1. Se prepararon perlas de látex unidas a HMGB1 (perlas HMGB1) reticulando HMGB1 recombinante con perlas de látex. La internalización de las perlas de látex se triplicó mediante la unión de HMGB1 a las perlas (Fig. 7a, b y Fig. complementaria 8a, b). En comparación con las células HEK293T de tipo salvaje, los niveles de internalización de las perlas HMGB1 disminuyeron en las células RAGE KO (Fig. 7b). Estos resultados sugieren que HMGB1 induce la fagocitosis mediante NPP.

a Imágenes representativas de células con perlas de látex internalizadas. Para HMGB1 o perlas de histonas, se unieron 49,57 o 44,40 fg/perla (respectivamente) de las proteínas a perlas de látex. Para perlas de ADN/HMGB1 o ADN/histonas, se unieron 65,94 o 61,39 fg/perla (respectivamente) de las proteínas a perlas de ADN (la cantidad de ADN1 unida fue 1,27 fg/perla). Las imágenes se obtuvieron con contraste de interferencia diferencial (DIC) o microscopía de fluorescencia (esporas y lisosomas). Los lisosomas se tiñeron con LysoTracker Red. Barra de escala, 10 µm. b Internalización de perlas de látex en células HEK293T o HEK293T RAGE KO. Se incubaron perlas de látex desnudas (control) o las perlas indicadas con células HEK293T o HEK293T RAGE KO. Para perlas de BSA, 48,02 fg/perla de perlas de látex unidas a proteínas. c Internalización de perlas de látex en células ATII. Los tipos indicados de perlas de látex se incubaron con células ATII primarias de ratón. d Internalización de perlas de látex en células ATII transfectadas con ARNip dirigidos a Rage. Las células ATII se transfectaron con dos ARNip dirigidos a Rage (ARNip1 y ARNip2) o un control de ARNip no dirigido (nc). Estas células se incubaron con las perlas indicadas como se describe en a. Los datos se presentaron como media ± SEM (b – d). La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Student no apareadas de dos colas. norte = 3 (b-d). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns no significativo (P ≥ 0,05).

Al igual que las perlas de látex unidas a polinucleótidos, los niveles de internalización de las perlas unidas a HMGB1 fueron más bajos que los de las esporas (compárese la Fig. 2a (control) y la Fig. 7b (ADN y HMGB1)). Como se describió anteriormente, esta diferencia puede indicar que las esporas muestran mayores densidades de ligando (ARN) que las perlas de látex (Figura complementaria 6b). Además, o alternativamente, la pared de esporas puede contener otra(s) sustancia(s) que pueden aumentar o inducir activamente la internalización. Respecto a esta última posibilidad, un estudio previo demostró que la respuesta inflamatoria mediada por RAGE se activa sinérgicamente por el ADN y HMGB135. Por analogía, encontramos que la internalización de perlas unidas a ADN y HMGB1 (doble etiqueta) (perlas de ADN/HMGB1) por células HEK293T fue mayor que la observada con ADN o perlas de HMGB1 (es decir, partículas con una sola etiqueta) (Fig. 7a, b). Para este ensayo, se prepararon perlas de ADN/HMGB1 adsorbiendo HMGB1 en perlas de ADN. En las perlas de ADN/HMGB1, HMGB1 parecía unirse al ADN en perlas de látex, dado que HMGB1 no fue absorbido por las perlas desnudas (Figura complementaria 8c). Los niveles de internalización de perlas de ADN por parte de las células HEK293T aumentaron mediante la unión de HMGB1 (Fig. 8c, d complementaria). Los niveles de internalización de perlas de ADN / HMGB1 por las células HEK293T RAGE KO fueron más bajos (Fig. 7b). Por tanto, el ADN y la HMGB1 aumentan sinérgicamente la fagocitosis mediada por RAGE.

Luego, realizamos un experimento similar utilizando otra proteína de unión al ADN, la histona. Se sabe que las histonas extracelulares actúan como DAMP36, pero anteriormente se había informado que no sirven como ligandos para RAGE. Así, primero, utilizamos histonas como control negativo. Sin embargo, las perlas marcadas con histonas se internalizaron en células HEK293T a niveles aproximadamente dos veces más altos que las perlas de ADN/HMGB1 (Fig. 7a, b y Fig. complementaria 9a, b). Por el contrario, las perlas marcadas con albúmina sérica bovina (BSA) no se internalizaron en las células HEK293T (Fig. 7b), lo que demuestra que la fagocitosis mediada por RAGE no es inducida por proteínas en general. En particular, la internalización de las perlas de histonas disminuyó mediante la eliminación de RAGE (Fig. 7b). Estos resultados sugieren que las histonas son otro ligando de RAGE. En apoyo de esta hipótesis, se precipitó RAGE-GFP con perlas de histonas, pero no con perlas de BSA, a partir de un lisado celular que alberga la proteína de fusión RAGE-GFP (Figura complementaria 9c). Como se vio con HMGB1, la internalización de las perlas de ADN mejoró mediante la unión adicional de histonas (Fig. 7a, b y Fig. complementaria 9d, e). En las células HEK293T RAGE KO, la internalización de las perlas de ADN/histonas disminuyó (Fig. 7b). Las células ATII de ratón también internalizaron perlas de histonas y perlas de ADN/histonas (Fig. 7c). Sin embargo, observamos que HMGB1 no indujo la internalización de perlas por células ATII (Fig. 7c). Además, a diferencia de las células HEK293T, las células ATII primarias de ratón fueron más eficientes para internalizar las esporas que cualquiera de las perlas artificiales modificadas (compárese la Fig. 6c (control) y la Fig. 7c). Sin embargo, la internalización de perlas de ADN/histonas o perlas de histonas por parte de las células ATII disminuyó mediante la eliminación de Rage (Fig. 7d), lo que muestra que la internalización de las perlas por parte de estas células primarias de ratón está mediada por la fagocitosis dependiente de Rage.

Finalmente, examinamos si se requiere RAGE para que las células HEK293T internalicen las células apoptóticas, que son objetivos bien conocidos para la fagocitosis mediante NPP in vivo2. Las células Jurkat se internalizaron en células HEK293T cuando se trataron con el inductor de apoptosis estaurosporina (Fig. 8a, b). Sin embargo, en las células HEK293T RAGE KO, los niveles de internalización de las células Jurkat tratadas con estaurosporina fueron aproximadamente cuatro veces más bajos que los de las células de tipo salvaje (Fig. 8b). Además, encontramos que los tamaños de las células Jurkat (fragmentos) internalizados en las células HEK293T RAGE KO eran más pequeños que los internalizados en las células de tipo salvaje (Fig. 8c). Estos resultados demuestran que la eferocitosis por NPP también está mediada por una vía dependiente de RAGE.

a Imágenes representativas de células HEK293T o HEK293T RAGE KO con células Jurkat apoptóticas internalizadas que expresan GFP obtenidas con contraste de interferencia diferencial (DIC) o microscopía de fluorescencia (células apoptóticas y lisosoma). Los lisosomas se tiñeron con LysoTracker Red. Barra de escala, 10 µm. b Internalización de células Jurkat apoptóticas en células HEK293T o HEK293T RAGE KO. Las células apoptóticas se incubaron con células HEK293T o HEK293T RAGE KO a 106 células Jurkat / 4–6 × 105 células RAGE KO de tipo salvaje o RAGE / ml. n = 3. c Distribución del tamaño de la célula Jurkat (fragmento) internalizada en células HEK293T (n = 50) o HEK293T RAGE KO (n = 50). El tamaño se determinó midiendo la dimensión más larga de las células internalizadas. Los datos se presentaron como media ± SEM (b). La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Student no apareadas de dos colas (b, c). **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.

La fagocitosis ocurre en las NPP3; sin embargo, el mecanismo no está claro. Aquí, demostramos que la fagocitosis por NPP está mediada por RAGE. Dado que las células inactivadas con RAGE exhiben actividad residual para internalizar partículas microdimensionadas, las NPP pueden estar equipadas con múltiples vías fagocíticas. Sin embargo, las NPP pueden fagocitar varias moléculas a través de la vía mediada por RAGE debido a la propiedad de reconocimiento de múltiples ligandos del receptor.

In vivo, se sabe que las NPP realizan eferocitosis2. Mostramos que RAGE puede mediar en la eliminación de cadáveres apoptóticos; presumiblemente, la PS en células apoptóticas sirve como ligando para este proceso. Aparte de los cadáveres de células, los objetivos de la fagocitosis de las NPP in vivo no estaban claros. Nuestros resultados sugieren que las NPP fagocitan varias macromoléculas que contienen ligandos RAGE. Se sabe que las macromoléculas que contienen ligandos RAGE están presentes en el espacio extracelular37,38. Por ejemplo, las células dañadas pueden liberar fragmentos de ADN unidos a histonas o HMGB1. Estas moléculas son objetivos potenciales para la fagocitosis mediada por RAGE. Curiosamente, la mayoría, si no todos, los ligandos RAGE son moléculas dañinas39,40. Sin embargo, el mecanismo subyacente de cómo RAGE puede reconocer múltiples ligandos dañinos espera un análisis estructural más profundo.

En informes anteriores se ha demostrado la unión directa entre RAGE y sus ligandos28,35; en la fagocitosis mediada por RAGE, lo más probable es que su unión induzca la vía de señalización. Descubrimos que la internalización de perlas de látex unidas a polinucleótidos aumentaba mediante la unión de otros ligandos RAGE de unión al ADN. El efecto sinérgico puede reflejar el hecho de que el complejo ADN/HMGB1 se une a RAGE con mayor afinidad que el ADN o HMGB1 solos, como se ha informado anteriormente35. Nuestro análisis farmacológico sugiere que SYK y PI3K están involucrados en la vía de señalización. Estas quinasas se conocen como moléculas de señalización posteriores en la fagocitosis1 mediada por el receptor Fcγ, lo que indica similitud entre las vías fagocíticas profesionales y no profesionales. El receptor Fcγ tiene un motivo de activación de inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) en el dominio citosólico1. SYK se une directamente al receptor Fcγ activado a través del motivo ITAM fosforilado. Sin embargo, a diferencia del receptor Fcγ, el motivo ITAM está ausente en el dominio citosólico de RAGE. Por tanto, la activación de la señalización fagocítica mediada por RAGE puede implicar una proteína adaptadora o correceptor. En particular, las células HEK293T y ATII primarias de ratón internalizan partículas con preferencias distintivas; Las células HEK293T fagocitan perlas de ADN/histonas de manera más eficiente, mientras que las células ATII prefieren las esporas. Este resultado sugiere que la eficiencia de internalización no está determinada únicamente por la afinidad de RAGE por las partículas. Por tanto, la eficiencia de la internalización puede estar mediada por uno o más correceptores adicionales.

Si bien en el presente informe nos centramos en el mecanismo de fagocitosis por las NPP, nuestro estudio también proporciona varios hallazgos interesantes desde la perspectiva de la microbiología. En particular, encontramos que los fragmentos de ARN se unen a la pared de las esporas. La pared de las esporas está equipada con maquinaria para contener el ARN, lo que sugiere que los fragmentos de ARN pueden ser beneficiosos para las esporas. Dado que S. cerevisiae es una levadura no patógena, es poco probable que el ARN unido a la pared de las esporas sea una maquinaria invasiva. Además de la pared de esporas, la presencia de ARN o ADN extracelular se informa en varias estructuras biológicas, incluidas las trampas extracelulares de neutrófilos y las biopelículas41,42. En estas estructuras, los polinucleótidos extracelulares se utilizan como materiales para proteger células u organismos. Por analogía, proponemos que el ARN unido a la pared de esporas tiene una función protectora. Dado que las esporas se forman en el citosol, sería razonable utilizar fragmentos de ARN que de otro modo serían inútiles como materiales protectores. Por tanto, sería interesante evaluar si el ARN está incluido en la pared de esporas de otros organismos. En la pared de esporas de levadura, los fragmentos de ARNt, especialmente ARNtAsp, se concentran en el ARN unido a la pared de esporas por razones desconocidas. En cultivos de células de mamíferos y biofluidos, los fragmentos de tRNAGly y tRNAGlu son los principales ARN extracelulares no vesiculares porque adoptan formas resistentes a la ARNasa43. Por lo tanto, en la levadura, tRNAAsp puede ser resistente a la digestión con RNasa en el citosol ascal. Alternativamente, el sesgo puede ser atribuible a la especificidad de unión de la maquinaria de unión al ARN presente en la pared de la espora.

Las esporas de levadura exhiben propiedades únicas en el sentido de que las NPP las internalizan de manera mucho más eficiente que las perlas de látex unidas a polinucleótidos. Hay dos posibilidades para explicar la fagocitosis eficiente de las esporas. Una es que las esporas podrían acomodar más polinucleótidos que las perlas de látex con grupos amina en la superficie. La otra posibilidad es que moléculas adicionales unidas al ARN en la pared de la espora podrían mejorar la eficiencia de la internalización, aunque actualmente la identidad de dicha molécula sigue siendo difícil de alcanzar. La maquinaria de unión al ARN en la pared de las esporas sería intrigante no sólo desde el punto de vista de la microbiología sino también para el desarrollo de sistemas de administración para células de mamíferos.

Se sabe que RAGE está implicado en varios trastornos44,45,46. La activación de RAGE puede inducir respuestas inflamatorias y se informa que muchos trastornos están relacionados con la inflamación crónica mediada por RAGE. Sin embargo, algunos trastornos, como las enfermedades infecciosas, pueden estar relacionados con la función de RAGE como receptor fagocítico. RAGE se expresa altamente en el pulmón, donde las células epiteliales encuentran una variedad de microorganismos47. Dado que las esporas de levadura se fagocitan en las NPP, otros microorganismos pueden internalizarse en los tejidos epiteliales mediante fagocitosis mediada por RAGE. En este contexto, cabe destacar que diversas bacterias forman biopelículas que contienen polinucleótidos. Se han informado implicaciones de RAGE en enfermedades infecciosas en modelos de ratón. Curiosamente, RAGE puede causar efectos beneficiosos o perjudiciales dependiendo de los organismos y condiciones patológicos44. Los resultados variables pueden atribuirse a la tolerancia del patógeno a los compartimentos endocíticos en las NPP; para algunos patógenos, el proceso fagocítico sería útil para la invasión del huésped. En apoyo de esta hipótesis, las esporas internalizadas en las células HEK293T están vivas y comienzan a germinar, lo que conduce a la muerte de las células cultivadas.

Dado que las NPP no están equipadas con mecanismos microbicidas, son vulnerables a los patógenos en comparación con los fagocitos profesionales. Por tanto, los fagocitos profesionales funcionan mejor en la eliminación de patógenos. En particular, un estudio previo demostró que la actividad fagocítica en las NPP es suprimida por el IGF-1 liberado por los fagocitos profesionales48. Esta regulación cruzada puede ser beneficiosa para prevenir la propagación de patógenos. Las NPP y los fagocitos profesionales pueden interactuar de diversas maneras y contribuir al desarrollo y mantenimiento de los tejidos y a la respuesta a la enfermedad. Esperamos que nuestros hallazgos allanen el camino para futuros análisis y conocimientos sobre las funciones fisiológicas de la fagocitosis por parte de las NPP.

Las células HEK293T, HEK293, HeLa y HUC se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Estas células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (Biological Industries) que contenía suero fetal bovino (FCS) al 10 % (v/v) (Biological Industries). Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Se adquirieron células ATII primarias de ratón de Procell y se cultivaron en medio especial para células ATII (Procell). Las células Jurkat se obtuvieron de ATCC y se cultivaron en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Biological Industries) que contenía FCS al 10 % (v/v). FCS se inactivó mediante incubación a 56 °C durante 45 minutos antes de la adición al medio. Se cultivaron células Jurkat que expresaban establemente GFP en RPMI 1640 que contenía FCS al 10% (v/v) y 5 μg/ml de blasticidina (InvivoGen). Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.

Las cepas de levadura utilizadas en este estudio son AN120 (tipo salvaje) (MATα/MATa ARG4/arg4-NspI his3∆SK/his3∆SK ho::LYS2/ho::LYS2 leu2/leu2 lys2/lys2 RME1/rme1:: LEU2 trp1::hisG/trp1::hisG ura3/ura3)49 y HW3 (dit1∆) (MATα/MATa ARG4/arg4-NspI his3∆SK/his3∆SK ho::LYS2/ho::LYS2 leu2/leu2 lys2 /lys2 RME1/rme1::LEU2 trp1::hisG/trp1::hisG ura3/ura3 dit1∆::his5+/dit1∆::his5+)50. Estas cepas son cepas de fondo SK-1 que esporulan con alta eficiencia51. Para expresar GFP en AN120, las cepas haploides49 se transformaron con pRS306TEF-GFP digerido con EcoRV y los transformantes se aparearon.

Las células de levadura se cultivaron en YPAD (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona, 30 mg/l de adenina y 20 g/l de glucosa). Se añadió agar (20 g/l) para preparar las placas. Las células de levadura se esporularon como se describió anteriormente50. Brevemente, se cultivaron células de levadura derivadas de una única colonia durante la noche en 5 ml de medio líquido YPAD. Se transfirió una alícuota de 0,1 ml del cultivo a 5 ml de YPAcatate (10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona y 20 g/l de acetato de potasio) y se cultivó durante la noche. Las células se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en medio de acetato de potasio al 2% a una concentración de 3 x 107 células/ml y se cultivaron durante 24 h.

Para liberar esporas de los ascos, los ascos se suspendieron en 5 ml de tampón de liticasa y se agregaron 20 µl de solución madre de liticasa (Sigma-Aldrich) (se disolvieron 10.000 U/ml en 500 µl de glicerol al 50%). Después de una incubación de 3 h a 37 °C, las esporas se lavaron dos veces con tampón liticasa. Luego, las esporas se resuspendieron en agua y se sonicaron con un disruptor ultrasónico (Xinchen Biological Technology) para romper la membrana asci. Las condiciones de sonicación fueron las siguientes: potencia, 45%; duración, 20 min con ciclos de 5 s encendido y 2 s apagado. Luego se lavaron las esporas tres veces con Tween-20 al 0,5% y dos veces con agua. El número de esporas se contó con un contador de plaquetas.

Las esporas lavadas con alto contenido de sal se prepararon mediante incubación de las esporas en una solución de NaCl 0,6 M durante 30 segundos y luego se lavaron dos veces con agua. Para tratar las esporas con RNasa A o DNasa I, se incubaron 2 × 107 esporas con 3 U de RNasa A (TaKaRa) o 3 U de DNasa I (Beyotime) en agua a 37 ° C durante 30 min. Las esporas se lavaron dos veces con agua. Para preparar esporas tratadas con proteinasa, se incubaron 2 x 107 esporas con 2 U de proteinasa (Sigma-Aldrich) en agua a 37 °C durante 30 minutos y se lavaron dos veces con agua.

Todos los oligonucleótidos y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en las Tablas complementarias 1 y 2, respectivamente. Para el sistema CRISPR-Cas9 utilizado para desactivar genes diana, se diseñaron secuencias de ARN guía utilizando el sitio web E-CRISP52 (RRID:SCR_019088), y los fragmentos de ADN correspondientes se ligaron en el vector pX330EGFP-hU6-gRNA-hSpCas953 digerido con BpiI. Los fragmentos de ADNc de RAGE y SYK se amplificaron a partir de ADNc derivado de células HEK293T y se clonaron en los vectores pME-tagRFP o pME-mEGFP54 para generar pME-RAGE-tagRFP, pME-RAGE-mEGFP y pME-SYK-mEGFP. Los mutantes RAGE del sitio de unión al ADN se construyeron con mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR. Se utilizó pME-Hyg-3FLAG54 para clonar RAGE1–341-His-FLAG. Las secuencias de los cebadores utilizados para introducir las mutaciones se enumeran en la Tabla complementaria 1. El fragmento de ADNc de TLR3 se amplificó a partir de ADNc humano derivado de células HEK293T. Los fragmentos de ADNc de TLR7 y TLR8 se amplificaron a partir de ADNc humano derivado de células THP1. TLR9 se amplificó a partir de un clon ORF humano UltimateTM (n.° de clon, IOH21944). Para construir el plásmido de expresión de GFP de levadura pRS306TEF-GFP, se amplificó GFP mediante PCR utilizando pFA6a-GFP (S65T)-HIS3MX655 como plantilla. El promotor TEF2 y el terminador CYC1 se obtuvieron de pRS316TEF56. Se usó pLIB2-mEGFP-BSD para producir células Jurkat que expresan GFP de manera estable. La GFP (mEGFP) se digirió a partir de pME-mEGFP.

Para la transfección de ADN plasmídico, las células se cultivaron hasta una confluencia del 60 % en portaobjetos de 24 pocillos y se transfectaron con ADN plasmídico (0,8 μg/pocillo) utilizando Lipofectamine™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante.

Se utilizó transfección basada en retrovirus57 para construir células Jurkat que expresan GFP de manera estable. Se transfectaron células HEK293T (106) con 1 μg de pGP, 1 μg de pLC-VSVG y 2 μg de pLIB2-mEGFP-BSD usando Lipofectamine™ 2000 según las instrucciones del fabricante. Después de 36 h de incubación, el medio se filtró con un filtro de 0,22 μm y se mezcló con la misma cantidad de DMEM suplementado con 16 μg/ml de bromuro de hexadimetrina (Sigma). El medio que contenía retrovirus se incubó con células Jurkat durante la noche. Después de 5 días de cultivo, las células que expresaban GFP se clasificaron utilizando un clasificador de células S3e (Bio-Rad).

Se colocó un cubreobjetos de vidrio redondo (14 mm de diámetro) en el fondo de placas de 24 pocillos. Se sembraron células (1,5 x 105/pocillo) en la placa y se les permitió crecer hasta una densidad de 2–3 x 105/pocillo. Las células se incubaron con 0,6 x 107 esporas durante 12 h a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Después de lavarlas dos veces con PBS (Sangon Biotech), las células se tiñeron con yoduro de propidio 10 μM durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de lavarlas con PBS tres veces, las células muertas se contaron bajo un microscopio de fluorescencia.

Para generar la línea celular inactivada RAGE, las células HEK293T se transfectaron transitoriamente con dos plásmidos, pX330-RAGE gRNA1 y pX330-RAGE gRNA2 (Tabla complementaria 2), que portaban los siguientes gRNA dirigidos a las regiones exónicas del gen RAGE: pX330-RAGE gRNA1 , CAAGAAACCACCCCAGCGGC; pX330-RAGE gRNA2, TCTTACGGTAGACACGGACT. Después de 3 días de incubación, las células que expresaban EGFP se clasificaron utilizando un clasificador de células S3e (Bio-Rad). Luego, las células recolectadas se cultivaron durante 8 días y se sometieron a dilución limitante para obtener candidatos a clones knockout para RAGE. Los clones que carecían de los alelos de tipo salvaje de la región objetivo se seleccionaron mediante PCR utilizando los cebadores RAGE check F1 y RAGE check R1 (Tabla complementaria 1), y los clones positivos se verificaron adicionalmente con secuencias de ADN utilizando el método de Sanger. La línea celular desactivada para TLR3 se generó de manera similar utilizando pX330-TLR3 gRNA1 y pX330-TLR3 gRNA2. Las secuencias de los gRNA ligados en pX330-TLR3 gRNA1 y pX330-TLR3 gRNA2 son GTACCTGAGTCAACTTCAGG y GCCTTGTATCTACTTTTGGG, respectivamente. Los cebadores de PCR utilizados para seleccionar clones que carecen de los alelos de tipo salvaje de la región objetivo fueron TLR3 check F1 y TLR3 check R1 (Tabla complementaria 1). La línea celular desactivada SYK se generó de manera similar utilizando pX330-SYK gRNA1 y pX330-SYK gRNA2. Las secuencias de los gRNA ligados en pX330-SYK gRNA1 y pX330-SYK gRNA2 son GGCAGAAGATTACCTGGTCC y GCTTCTTGAGGAGGCAGACC, respectivamente. Los cebadores de PCR utilizados para seleccionar clones que carecen de los alelos de tipo salvaje de la región objetivo fueron SYK check F1 y SYK check R1 (Tabla complementaria 1).

La eliminación de Rage en células ATII de ratón se realizó con ARN de interferencia (ARNi) con ARN de interferencia pequeño (ARNip). Un ARNip (siRNA1) se adquirió de Santa Cruz Biotechnology y el otro siRNA (siRNA2) (sentido, 5′-3 ′ GCACUUAGAUGGGAAACUUTT y antisentido, 5′-3 ′ AAGUUUCCCAUCUAAGUGCTT) se adquirió de GenePharma. Se sembraron células ATII (2,5 x 104) en placas de 24 células y se cultivaron durante 20 h; luego, se transfectaron 20 pmol de ARNip con el reactivo de transfección de ARNip GenMuteTM (SignaGen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de ARNip no dirigidos fueron las siguientes: sentido 5′-3′ UUCUCCGAACGUGUCACGUTT; antisentido 5′-3′ ACGUGACACGUUCGGAGAATT. Después de 36 h de incubación, las células se sometieron a qRT-PCR o ensayos de internalización de esporas o perlas de látex.

El ARN se aisló de cada célula utilizando el kit de preparación de ARN directo CellAmpTM para RT-PCR (TaKaRa). El ADNc de la primera cadena se sintetizó utilizando PrimeScriptTM RT Master Mix (TaKaRa). La reacción se realizó en una mezcla de reacción de 20 µl. Los ADNc se almacenaron a -20 °C. Para qRT-PCR, la mezcla de reacción se preparó con TB Green® Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la PCR se realizó con un sistema de detección de secuencia Prism 7000 (Applied Biosystems). Los cebadores utilizados para la PCR se enumeran en la Tabla complementaria 1. La PCR se realizó en las siguientes condiciones: 95 °C durante 30 s, 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s seguido de una ejecución de disociación estándar. para obtener perfiles de curva de fusión de los amplicones. Utilizando el método 2-ddCt, la expresión relativa del ARNm interno de los genes diana se normalizó a GAPDH.

Se incubaron aproximadamente 5 × 108 esporas suspendidas en agua a 62 °C durante 60 min. Para analizar la viabilidad de las esporas, se colocaron 3 × 107 de esporas en la placa YPAD y se incubaron a 30 °C durante 2 días.

Para la expresión y purificación de RAGE1–341-His-FLAG, se transfectó pME-Hyg-RAGE1–341-His-FLAG en células HEK293 cultivadas en placas de 15 cm. Después de 12 h de incubación, se intercambió el medio y las células se cultivaron adicionalmente durante 36 h. El medio se recogió y se centrifugó a 3000 xg durante 3 minutos para eliminar las células y los restos. Luego, el medio se pasó a través de una columna de trampa His de alto rendimiento (GE Healthcare). La columna se lavó con PBS y RAGE1–341-His-FLAG se eluyó con tampón de elución (imidazol 200 mM). Para la extracción de RAGE1–341-His-FLAG con perlas unidas a ARNt, el RAGE truncado se purificó aún más con perlas de agarosa con afinidad anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich). Se mezcló 1 ml de RAGE1–341-His-FLAG de la columna de trampa His de alto rendimiento con 50 µl de perlas de agarosa de afinidad anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich) prelavadas con PBS y rotadas a 4 ° C durante 2 h. Las perlas de agarosa se lavaron con PBS cuatro veces y el RAGE1-341-His-FLAG recombinante se eluyó con PBS que contenía 500 µg/ml de péptido FLAG.

Se colocó un cubreobjetos de vidrio redondo (14 mm de diámetro) en el fondo de placas de 24 pocillos. Se sembraron células (1,5 x 105/pocillo) en la placa y se les permitió crecer hasta una densidad de 2 a 3 x 105 células/pocillo. El ensayo se realizó en 500 µl de medio de cultivo suplementado con 0,025 µl de LysoTracker (Beyotime). Se incubaron células de mamífero y esporas purificadas o perlas de látex (2 µm de diámetro, Sigma-Aldrich) en una incubadora de CO2 a 37 °C durante 1 h. A menos que se indique lo contrario, las esporas o perlas de látex se incubaron con células cultivadas a 1,2 x 107 esporas o perlas/4–6 x 105 células cultivadas/ml en DMEM suplementado con LysoTracker. Luego, las células se colocaron en hielo y se lavaron dos veces con PBS, y las esporas o perlas intracelulares se analizaron bajo un microscopio de fluorescencia. Para las células que expresan RFP o fusión RFP (Fig. 5a, b y Fig. complementaria 7b), se analizaron al menos 50 células cultivadas. Para el otro ensayo, se analizaron al menos 100 células cultivadas. Las esporas observadas en los compartimentos positivos para LysoTracker se definieron como partículas internalizadas. Para el ensayo de inhibición competitiva con polinucleótidos, se añadió ARN o ADN al medio de ensayo a una concentración de 90 µg/ml antes de la adición de las esporas. Se agregaron wortmanina, piceatannol o latrunculina A a una concentración final de 100 nM, 50 μM o 10 nM, respectivamente, 30 minutos antes de la adición de esporas o perlas.

Para el análisis del tamaño de las esporas internalizadas, se utilizó el software NIS-Element AR (Nikon) para medir la dimensión más larga de las esporas. Se analizaron cuarenta esporas.

Se sembraron células (2 x 105/pocillo) en placas de 12 pocillos y se les permitió crecer hasta una densidad de 4 a 6 x 105 células/pocillo. Las células se incubaron con 1,2 x 107 esporas que expresaban GFP en una incubadora de CO2 a 37 °C durante 1 h. Luego, las células se trataron con tripsina durante 5 minutos y se lavaron dos veces con PBS. Las muestras fueron analizadas por BD FACS AriaIII (BD). Los datos se analizaron utilizando FlowJo X (BD).

Se recogieron células Jurkat del cultivo y se resuspendieron a una densidad de 106/ml en RPMI 1640 que contenía FCS al 10%. La apoptosis se indujo durante 12 h con estaurosporina 1,0 μM (Beyotime). Después de 12 h de incubación, las células apoptóticas se centrifugaron a 860 xg durante 3 minutos a 4 °C y se lavaron dos veces con PBS.

Se colocó un cubreobjetos de vidrio redondo (14 mm de diámetro) en el fondo de placas de 24 pocillos. Se sembraron células HEK293T o HEK293T RAGE KO (1,5 x 105/pocillo) en la placa que contenía 500 µl de DMEM y se dejaron crecer hasta una densidad de 2–3 x 105 células/pocillo. Se agregaron células Jurkat apoptóticas al cultivo a razón de 106 células apoptóticas/4–6 × 105 células de tipo salvaje o RAGE KO/ml. Después de 2 h de incubación en una incubadora de CO2 a 37 °C, se agregaron 0,025 µl de LysoTracker Red al medio de cultivo y se incubaron durante 10 min. Luego, las células se colocaron en hielo y se lavaron dos veces con PBS, y las células apoptóticas intracelulares se analizaron bajo un microscopio de fluorescencia. Las células apoptóticas con fluorescencia verde observadas en compartimentos positivos para LysoTracker en células HEK293T o HEK293T RAGE KO se definieron como células apoptóticas internalizadas. Para el ensayo, se analizaron al menos 300 células cultivadas. Se utilizó el software NIS-Element AR (Nikon) para analizar el tamaño (la dimensión más larga de las células internalizadas) de las células apoptóticas en el lisosoma.

Un total de 2 × 108 esporas suspendidas en 500 µl de NaCl 0,6 M se agitaron a temperatura ambiente durante 30 s. Después de la centrifugación a 21.500 xg durante 10 min a 4 °C, el ARN se purificó del sobrenadante con RNAiso plus (TaKaRa) según las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se midió utilizando un NanoDrop 2000/2000c (Thermo Fisher Scientific).

El ARN unido a la pared de esporas se preparó como se describe anteriormente. La secuenciación del ARN fue realizada por Genesky Biotechnologies. La muestra de ARN se aplicó al bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies) para analizar su distribución de tamaño (Figura complementaria 10a). La muestra de ARN (sin fragmentación) se ligó con adaptadores Illumina (120 nt) para formar productos de ligadura diana y se generaron ADNc mediante transcripción inversa. Luego, los fragmentos de ADNc se amplificaron con PCR. Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% para separar los adaptadores y los fragmentos de ADN diana (Figura complementaria 10b). Según el resultado del Bioanalizador, se cortó la señal de frotis de ADN detectada de 140 a 250 pb en el gel de poliacrilamida y se recuperaron fragmentos de ADN del gel. Los fragmentos de ADN se secuenciaron en un secuenciador de mesa Illumina MiSeq (Illumina). Los datos de la secuencia se han depositado en la base de datos NCBI Sequence Read Archive con el número de acceso PRJNA748575. La distribución de la longitud del ARN se analizó con FastQC58.

Las lecturas de MiSeq de extremos emparejados se recortaron con un adaptador (Trimmomatic59) y las lecturas de extremos emparejados superpuestas se fusionaron utilizando PEAR60. Las lecturas se asignaron al genoma utilizando BWA-MEM61 y la fracción de lecturas asignadas a cada clase de gen se determinó utilizando el archivo GFF (columna 3) de la liberación del genoma R64 de SGD62.

Para la preparación de esporas lavadas con sal unidas a polinucleótidos, las esporas se lavaron una vez con NaCl 0,6 M y dos veces con agua. Se incubaron un total de 2 × 108 esporas suspendidas en 1 ml de agua con polinucleótidos a 4 ° C durante 24 h con rotación. Luego, las esporas se centrifugaron a 1000 xg durante 5 min a 4 °C y se lavaron dos veces con agua. El número de esporas se contó con un contador de plaquetas.

Para la preparación de perlas de látex unidas a ADN, se lavaron dos veces con agua 40 µl de perlas de látex. Se incubaron un total de 2 × 108 perlas suspendidas en agua con ARN de pared de esporas, ARNt (Sigma-Aldrich) o ADN1 con rotación a 4 ° C durante 24 h. El número de perlas se contó con un contador de plaquetas. Luego, las perlas se centrifugaron a 21.500 xg durante 5 minutos a 4 °C y se lavaron dos veces con agua. Para la preparación de perlas de ADN (perlas unidas a ADN1), se incubaron 2 x 108 perlas de látex con 200 ng de ADN1 en 1 ml de agua a 4 ° C durante 24 h y se lavaron como se describe anteriormente.

Para medir las cantidades de polinucleótidos unidos a esporas o perlas, se suspendieron esporas o perlas unidas a polinucleótidos en 200 µl de NaCl 0,6 M y se agitaron a temperatura ambiente durante 30 s. Luego, las esporas o perlas se centrifugaron a 21.500 xg durante 5 minutos a 4 °C. El ARN se purificó del sobrenadante con RNAiso plus. El ADN se purificó mediante precipitación con isopropanol. La concentración de ARN o ADN se midió utilizando un NanoDrop 2000/2000c.

Para generar perlas de ADN/HMGB1 o ADN/histona, se incubaron 108 perlas unidas a ADN suspendidas en 55 µl de agua con HMGB1 (Sangon Biotech) o histona (Sangon Biotech) con rotación a 4 °C durante 24 h. Las perlas se centrifugaron a 21.500 xg durante 5 minutos a 4 °C y se lavaron dos veces con agua. La cantidad de proteína unida a las perlas se determinó restando la cantidad residual de proteína de la cantidad original. Se utilizó el kit BCA (Beyotime) para medir las cantidades de proteína. Para generar perlas de látex unidas a HMGB1, histonas o BSA, primero se incubaron 2 × 108 perlas de látex en 500 µl de agua suplementada con glutaraldehído al 4% (Aladdin) a 30 ° C durante 2 h y se lavaron dos veces con agua. Se incubaron un total de 108 perlas modificadas con glutaraldehído con HMGB1, histona o BSA (Sangon Biotech) en 55 μl de agua a 4 ° C durante 24 h con rotación. Luego, las perlas se lavaron dos veces con agua.

Para la preparación de perlas unidas a ARNt, se incubaron 2 x 108 perlas de látex con 200 ng de ARNt en 1 ml de agua a 4 ° C durante 24 h y se lavaron dos veces con agua. Se incubaron setecientos microgramos de RAGE1–341-His-FLAG purificado (después de la purificación con perlas de agarosa con afinidad anti-FLAG M2) con 1,5 × 108 perlas desnudas o perlas unidas a ARNt en 50 µl de PBS a 4 ° C durante 2 h con rotación. . Luego, las perlas se lavaron tres veces con PBS. La proteína unida a las perlas se eluyó hirviendo en 50 µl de tampón de muestra SDS y se analizaron 10 µl de las muestras mediante transferencia Western.

Un mililitro de RAGE1–341-His-FLAG eluido de la columna de trampa His de alto rendimiento se incubó con 50 µl de perlas de agarosa con afinidad anti-FLAG M2 prelavadas (Sigma-Aldrich) para unir el RAGE truncado a las perlas de agarosa. Las perlas se lavaron tres veces con PBS y se suspendieron en 50 µl de agua libre de RNasa. Luego, se mezclaron 20 µl de perlas de agarosa unidas a RAGE1–341-His-FLAG con 1,5 µg de ARN fusionado a cianina 3 (Cy3) en el extremo 5' suspendido en 60 µl de agua libre de RNasa. La mezcla se incubó a 4 °C durante 2 h. Después de lavar tres veces con agua libre de RNasa, las perlas se suspendieron en 200 µl de agua libre de RNasa y se aplicaron 150 µl de la muestra al lector de microplacas multimodo Synergy H4 Hybrid con excitación de 570 nm y emisión de 650 nm para la cuantificación de la fluorescencia. .

Se lavaron dos veces con agua un total de 6 × 108 perlas de látex y se incubaron con glutaraldehído al 4% a 30 °C durante 2 h. Después de centrifugar a 21.500 xg durante 5 minutos a 4 °C, las perlas se lavaron dos veces con agua. Se incubaron perlas modificadas con glutaraldehído (3 × 108) con 80 µg de histona o BSA a 4 ° C en 100 µl de agua durante 12 h con rotación. Después de lavar dos veces con agua, las perlas se incubaron con BSA al 10 % a 4 °C durante 1 h para bloquear el glutaraldehído libre.

Se transfectaron células HEK293T cultivadas en placas de 6 cm con pME-mEGFP o pME-RAGE-mEGFP usando Lipofectamine 2000 y se incubaron durante 36 h. Luego, las células se lavaron con PBS y se incubaron con 500 µl de tampón de lisis (HEPES 25 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, NP40 al 0,1%) suplementado con 5 µl de cócteles inhibidores de proteasa (MCE) sin EDTA en hielo durante 30 minutos. mín. Después de la centrifugación a 21.500 xg durante 10 minutos a 4 ° C, se incubaron 100 µl del sobrenadante con 1,5 x 108 perlas unidas a histonas o BSA con rotación. Luego, las perlas se lavaron cuatro veces con tampón de lisis. Las proteínas unidas a las perlas se eluyeron hirviendo en 50 µl de tampón de muestra SDS (Tris-HCl 50 mM, pH 6,8, SDS al 2 %, azul de bromofenol al 0,1 %, glicerol al 10 % y 1-mercapto-11-hidroxi-1 %). 3,6,9-trioxaundecano) y 10 µl de las muestras se analizaron mediante transferencia Western. El uno por ciento del lisado después de la centrifugación se utilizó como muestra de entrada para la transferencia Western.

Para detectar RAGE endógeno, se suspendieron células HEK293T y HEK293T RAGE KO cultivadas en placas de 10 cm en 500 µl de tampón de homogeneización (HEPES 10 mM, pH 7,4, manitol 0,22 M y sacarosa 0,07 M) suplementado con 5 µl de proteasa libre de EDTA. cócteles inhibidores (MCE). Las células se homogeneizaron en hielo 40 veces. Los homogeneizados se transfirieron a tubos de 1,5 ml y se centrifugaron a 1000 xg durante 5 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se centrifugaron adicionalmente a 100.000 xg durante 1 h a 4 °C. Los sedimentos se resuspendieron en 100 µl de tampón de homogeneización. Luego, se hirvieron 10 µl de muestras mezcladas con tampón de muestra SDS y se sometieron a SDS-PAGE al 10%. Para detectar un control de carga, GLUT1, se sometieron 10 μl de las muestras sin hervir a SDS-PAGE al 10%.

Para detectar la fusión de tagRFP con RAGE, TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9, se suspendieron células HEK293 que albergaban los plásmidos pME-TLR3-tagRFP, pME-TLR7-tagRFP, pME-TLR8-tagRFP o pME-TLR9-tagRFP en 500 μl de tampón de lisis suplementado con cócteles inhibidores de proteasa en hielo durante 30 min. Después de la centrifugación a 21.500 xg durante 10 minutos a 4 °C, se suspendieron 20 µg de estas muestras en un tampón de muestra SDS. Después de hervir las muestras, se sometieron a SDS-PAGE al 6%. Después de SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon en leche al 5 % (Sangon Biotech) en tampón TBST (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,05 % (v/v)) y se sondaron con los anticuerpos apropiados diluidos en QuickBlockTM. Tampón de dilución de anticuerpos primarios (Beyotime) durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Después de lavar con TBST tres veces, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP diluidos en leche al 5% en tampón TBST durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron tres veces en tampón TBST. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-RAGE de conejo (Abcam, 1: 2000); anti-SYK de conejo (Abcam, 1: 3000); anti-RFP de conejo (InvivoGen, 1:3000); anti-GFP de ratón (TransGen Biotech, 1:3000); anti-GLUT1 de conejo (Abcam, 1:4000); antiactina de ratón (TransGen Biotech, 1:3000); ratón anti-His (TransGen Biotech, 1:5000). Los anticuerpos primarios se detectaron utilizando la IgG anti-ratón ligada a HRP secundaria (TransGen Biotech, 1:5000) o la IgG anti-conejo ligada a HRP (TransGen Biotech, 1:5000). Las señales se detectaron con sustrato ECL (Bio-Rad). Las imágenes se capturaron utilizando un sistema automático de análisis de imágenes por quimioluminiscencia Tanon 5200.

Las imágenes de microscopía se obtuvieron utilizando un microscopio invertido Nikon C2 Eclipse Ti-E con una cámara DS-Ri (imágenes en vivo e imágenes de levadura) o un microscopio de escaneo láser confocal invertido Nikon C2 Eclipse Ti-E (las otras imágenes) equipado con NIS-Element. Software de RA.

Para obtener imágenes en vivo, las células transfectadas transitoriamente con RAGE-mEGFP se cultivaron en placas con fondo de vidrio con 1,5 ml de DMEM. Cuando la densidad celular alcanzó una confluencia de ~80%, se agregaron 0,06 µl de LysoTracker Red al medio de cultivo y se incubaron durante 20 minutos. Luego, los medios de cultivo se intercambiaron con esporas suplementadas con DMEM precalentadas (1,5 x 107/ml). Después de 20 minutos de incubación, la placa se sometió a imágenes en vivo.

El análisis cuantitativo de RAGE-RFP en copa fagocítica y membrana plasmática se realizó de la siguiente manera. Las células HEK293T que expresan RAGE-RFP se incubaron con esporas (1,2 x 107 esporas/4–6 x 105 células cultivadas/ml) durante 40 minutos. Después de lavar dos veces con PBS, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% (vol/vol) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavaron con PBS dos veces. Las intensidades fluorescentes se midieron en ciertas áreas seleccionadas (32 × 55 píxeles) en la copa fagocítica (membrana plasmática que envuelve las esporas) y en aquellas adyacentes a cada copa fagocítica. Las intensidades medias de píxeles de las áreas seleccionadas se obtuvieron con el software NIS-Element AR.

El análisis estadístico de los datos se realizó utilizando el software GraphPad Prism 8 (software GraphPad). Todos los valores se presentan como medias ± SEM (n como se indica en las leyendas de las figuras). La significancia estadística se determinó con una prueba t de Student no apareada de dos colas. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y su información complementaria. Los datos de secuenciación de ARN se han depositado en la base de datos NCBI Sequence Read Archive (número de acceso PRJNA748575). Los datos de origen de los gráficos presentados en las figuras están disponibles en Datos complementarios 1. Las inmunotransferencias y geles sin editar se proporcionan como Figs. 11-13 en el archivo de información complementaria. Se obtuvieron más datos relevantes de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

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Agradecemos a Aaron Neiman (Stony Brook University) por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el programa nacional de disciplina de primera clase de Tecnología e Ingeniería de la Industria Ligera (LITE2018-015), Proyecto 111 (111-2-06), Centro de Innovación Colaborativa de Fermentación Industrial Moderna de Jiangsu, Laboratorio Internacional Conjunto de Investigación para la producción. de glicoproteínas terapéuticas en la Universidad de Jiangnan a X.-DG, fondos de investigación fundamental para las universidades centrales a HN (JUSRP51629B) y subvenciones NSFC a HN (32071467) y X.-DG (21778023).

Laboratorio clave de química y biotecnología de carbohidratos, Ministerio de Educación, Escuela de Biotecnología, Universidad de Jiangnan, Wuxi, 214122, China

Yan Yang, Guoyu Liu, Feng Li, Changjin Sun, Kaiping Ling, Morihisa Fujita, Xiao-Dong Gao y Hideki Nakanishi

Centro de Biología Cuantitativa y Centro Peking-Tsinghua de Ciencias de la Vida, Academia de Estudios Interdisciplinarios Avanzados, Universidad de Pekín, Beijing, 100871, China

Lucas B. Carey

Ginkgo Bioworks, Boston, MA, 02210, EE. UU.

Lucas B. Carey

Departamento de Química Biológica Aplicada, Escuela de Graduados en Ciencias Agrícolas y Biológicas, Universidad de Tokio, Tokio, 113-8657, Japón

Hiroyuki Tachikawa

Instituto de Investigación Colaborativa para Microbiología Innovadora, Universidad de Tokio, Tokio, 113-8657, Japón

Hiroyuki Tachikawa

Instituto de Investigación de Glyco-core (iGCORE), Universidad de Gifu, Gifu, 501-1193, Japón

Fujita Morihisa

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Conceptualización, HN, HT e YY; metodología, YY, HN y MF; validación, YY, GL y HN; análisis formal, YY, LBC y HN; investigación, YY, HN, GL, FL, CS y KL; redacción: preparación del borrador original, YY y HN; redacción: revisión y edición, HN, YY, HT, MF, FL y X.-DG; supervisión y adquisición de financiación X.-DG y HN; Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Xiao-Dong Gao o Hideki Nakanishi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Yong Jiang y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: Jesmond Dalli y Manuel Breuer. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Yang, Y., Liu, G., Li, F. et al. El receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE) media la fagocitosis en fagocitos no profesionales. Común Biol 5, 824 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03791-1

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Recibido: 30 de diciembre de 2021

Aceptado: 03 de agosto de 2022

Publicado: 16 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03791-1

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