Síntesis instantánea y caracterización completa de compuestos orgánicos.

Jul 31, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 9297 (2022) Citar este artículo

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Se desarrolló un enfoque novedoso denominado "método concentrado" para la fabricación instantánea de nanoflores híbridas (HNF) de lacasa@Co3(PO4)2•. Los HNF construidos se obtuvieron optimizando la concentración de cloruro de cobalto y tampón fosfato para alcanzar la mayor recuperación de actividad. La incorporación de CoCl2 30 mM y tampón fosfato 160 mM (pH 7,4) dio como resultado un rápido crecimiento anisotrópico de los nanomateriales. El método propuesto no implicó condiciones duras ni una incubación prolongada de precursores, como los enfoques más reportados para la síntesis de HNF. La eficiencia catalítica de la lacasa inmovilizada y libre fue 460 y 400 M-1S-1, respectivamente. Además, la actividad enzimática del biocatalizador preparado fue del 113% de la enzima libre (0,5 U mL-1). La estabilidad de los HNF sintetizados mejoró en un 400% a un pH de 6,5 a 9,5 y a temperaturas elevadas. La actividad de lacasa@Co3(PO4)2•HNF disminuyó al 50% del valor inicial después de 10 ciclos de reutilización, lo que indica una inmovilización exitosa de la enzima. Los estudios estructurales revelaron un aumento del 32% en el contenido de hélice α después de la hibridación con fosfato de cobalto, lo que mejoró la actividad y la estabilidad de la lacasa inmovilizada. Además, los HNF fabricados mostraron una capacidad considerable para eliminar la moxifloxacina como contaminante emergente. El antibiótico (10 mg L-1) se eliminó en un 24% y un 75% después de 24 h mediante adsorción y biodegradación, respectivamente. Este estudio presenta un nuevo método para sintetizar HNF, que podría usarse para la fabricación de biocatalizadores, biosensores y adsorbentes eficientes para aplicaciones industriales, biomédicas y ambientales.

La presencia de microcontaminantes como productos farmacéuticos, productos de cuidado personal (PCP), compuestos fenólicos y estrogénicos en las aguas residuales es una preocupación creciente1,2. Durante las últimas dos décadas, se han desarrollado varios biocatalizadores heterogéneos para aplicaciones ambientales e industriales3. Se ha utilizado una amplia gama de enzimas como lacasa, manganeso peroxidasa y peroxidasa de rábano picante para la eliminación de microcontaminantes. Aunque la actividad de las enzimas tras la inmovilización puede disminuir, las enzimas inmovilizadas son reutilizables y más estables frente a las condiciones operativas4. En este sentido, se desarrollaron tecnologías de inmovilización de enzimas sobre diversos soportes orgánicos e inorgánicos como fibras electrohiladas, nanopartículas magnéticas, membranas, polímeros naturales, etc.5,6,7.

La moxifloxacina, como fluoroquinolona (FQ) de cuarta generación, es responsable de más del 34,6% del consumo total de FQ en China8. Se utiliza principalmente para el tratamiento de la neumonía y las infecciones de la piel. Recientemente, debido a su uso en el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2, el consumo de moxifloxacina ha aumentado temporalmente. Por tanto, el consumo, liberación y acumulación de moxifloxacino en el medio ambiente pueden resultar amenazantes8. La moxifloxacina es también la FQ más tóxica contra el crecimiento de Pseudokirchneriella subcaptitata9. Asimismo, exhibió importantes efectos negativos sobre el crecimiento y reproducción de Ceriodaphnia dubia y Daphnia manga10. Por lo tanto, el aumento del consumo y la liberación de moxifloxacino en el medio ambiente puede suponer una amenaza para el ecosistema y la salud humana. La eficacia de los enfoques actuales para la eliminación de antibióticos de las aguas residuales es limitada11. En este sentido, hasta el momento se han establecido diversas técnicas para la eliminación de antibióticos, como la biocatálisis12, la fotocatálisis13, la electrocatálisis14, etc. Las lacasas, una enzima oxidorreductasa, se han utilizado ampliamente para aplicaciones medioambientales e industriales15,16. Se han incorporado lacasas libres e inmovilizadas para la bioeliminación de una amplia gama de contaminantes como bisfenol A, cristal violeta, naranja ácido-7, levofloxacino, etc.17,18,19,20. Sin embargo, no se informó anteriormente sobre la eliminación de moxifloxacino mediante enzimas (libres o inmovilizadas).

Es de gran interés la preparación de nuevas plataformas basadas en materiales híbridos orgánicos-inorgánicos para la inmovilización de enzimas. Las nanoflores híbridas orgánicas-inorgánicas (HNF) son nanoestructuras jerárquicas en forma de flor que se descubrieron inicialmente en 201221. Las HNF, compuestas de enzimas y componentes inorgánicos, tienen una gran superficie, un procedimiento de síntesis sencillo y estructuras porosas jerárquicas22 . Se informó que la coordinación entre el átomo de nitrógeno del componente orgánico y el ión metálico de la parte inorgánica es responsable de la formación de HNF21. Debido a sus interesantes propiedades, los HNF se han utilizado ampliamente en biocatálisis, biodetección y biomedicina23. Los biosensores basados ​​en HNF proporcionan un límite de detección (LOD) más bajo y tiempos de respuesta más rápidos debido a la adsorción y concentración de contaminantes que rodean las enzimas24. Se han incorporado biocatalizadores basados ​​en HNF para la eliminación de contaminaciones orgánicas como compuestos fenólicos y colorantes industriales23. Además, debido a la liberación de la biomolécula inmovilizada que responde al pH, los HNF se han incorporado como plataforma de administración de fármacos25. Se ha informado que después de incorporar enzimas en HNF, su actividad, estabilidad y reutilización han aumentado notablemente, debido a las bajas limitaciones de transferencia de masa que surgen de su alta relación superficie-volumen y los efectos cooperativos entre enzimas e iones metálicos26. Por ejemplo, la incorporación de lipasa en Zn3(PO4)2·HNF dio como resultado una mejora del 147 % de la actividad enzimática. Además, la estabilidad de almacenamiento de los HNF que contienen lipasa fue tres veces mayor que la de la lipasa libre27. La anhidrasa carbónica (CA) se inmovilizó con éxito en Ca8H2(PO4)6•HNF y exhibió una notable estabilidad frente a temperaturas elevadas (30–80 °C). CA@Ca8H2(PO4)6•HNF retuvo el 100% de su actividad inicial de hidratación de CO2 después de 5 ciclos de reutilización28. La adición de sulfato de cobre a solución salina tampón fosfato (PBS) en presencia de albúmina sérica bovina (BSA) dio como resultado la síntesis de BSA@Cu3(PO4)2•HNFs21 con forma de flor. Se han informado tres enfoques para la preparación de HNF, incluida la precipitación en un solo paso21, la sonicación ultrarrápida29 y la síntesis mediada por esfuerzo cortante30. En el método de precipitación en un solo paso, una estrategia sencilla y sencilla, la fabricación de HNF requiere un tiempo de incubación prolongado (de 1 a 3 días). Dado que un procedimiento de síntesis prolongado puede reducir potencialmente la estabilidad del constituyente orgánico, se han realizado intentos serios para acortar el tiempo de ensamblaje. En este método, la mezcla de síntesis que contenía Cu2+, ion fosfato y BSA se sonicó durante 5 minutos en un baño sonicador (40 kHz, 70 W), lo que resultó en la formación de BSA@Cu3(PO4)2•HNFs florecidos29. Recientemente se informó sobre la introducción de tensión de corte en el componente orgánico y los precursores inorgánicos para sintetizar HNF a base de cobre30,31. La mezcla de sulfato de cobre, BSA y PBS se añadió a un dispositivo fluídico de vórtice (VFD) y se hizo girar vigorosamente a una velocidad de rotación de 9000 rpm con un ángulo de inclinación de 45°. Después de 2 minutos, aparecieron estructuras toroidales con un vacío central, que formaron la morfología esférica final de los HNF31.

Teniendo en cuenta el hecho de que los HNF se encuentran en las primeras etapas de desarrollo, el mecanismo de formación de los HNF no se ha establecido con precisión. Sin embargo, se cree que la formación de sitios de nucleación primarios de fosfatos metálicos y moléculas orgánicas (por ejemplo, proteínas, ADN, etc.) y el crecimiento anisotrópico dependiente del tiempo de estos sitios de nucleación primarios son responsables de la formación. de las estructuras en forma de flores. Parece que al introducir energía cinética a los precursores, proporcionada por ultrasonidos y agitación, se redujo el tiempo de ensamblaje de los HNF. Como biocatalizadores eficientes, los HNF se han utilizado para la eliminación de contaminantes emergentes, como los tintes industriales. Sin embargo, la capacidad de los HNF para eliminar antibióticos no se ha informado previamente26.

El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar un método novedoso y rápido para la síntesis de HNF. La incubación prolongada, el esfuerzo cortante y la ultrasonicación de la mezcla de reacción son los enfoques más reportados para la fabricación de HNF. En este sentido, se optimizó la concentración de iones cobalto (II) incorporados y el tampón fosfato para alcanzar la mayor recuperación de actividad. Mediante la introducción de una concentración relativamente alta de precursores en la mezcla de reacción, se sintetizaron instantáneamente lacasa@Co3(PO4)2•HNF mediante un rápido crecimiento anisotrópico de nanocristales de fosfato de lacasa-cobalto, y se propuso un nuevo mecanismo para la síntesis de HNF. . Se investigaron las propiedades biocatalíticas de lacasa@Co3(PO4)2•HNF y también se caracterizó la estructura de la enzima hibridada. Luego se emplearon los HNF sintetizados para eliminar la moxifloxacina de los medios acuosos. Se identificaron los productos de degradación y se evaluó su toxicidad frente a cuatro bacterias implicadas en la degradación de compuestos orgánicos.

Lacasa de Trametes versicolor (0,5 U mg-1) y ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, EE. UU.). El hexahidrato de cloruro de cobalto (II) (CoCl2.6H2O) se obtuvo de Merck (Darmstadt, Alemania). Todos los demás reactivos y productos químicos aplicados eran de calidad analítica sin purificación adicional. La moxifloxacina fue amablemente donada por Soha Pharmaceutical Company (Teherán, Irán).

Independientemente de los métodos convencionales, se aplicó una estrategia instantánea para la construcción de HNF. El procedimiento de síntesis se realizó mediante la adición de 0,1 ml de solución de CoCl2 a 0,9 ml de tampón fosfato (pH 7,4) que contenía 0,1 U ml-1 de lacasa. Al instante apareció en la solución una gran cantidad de precipitados de color púrpura. Posteriormente se optimizaron la concentración adecuada de CoCl2 y la molaridad del tampón fosfato frente a la recuperación de actividad más alta (n = 3, valor de p <0,05). Los precipitados se centrifugaron a 6000 gy se lavaron tres veces con tampón fosfato. Los productos de color púrpura se marcaron como lacasa@Co3(PO4)2·HNF.

Se aplicaron imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) (Tescan, MIRA II, República Checa) para indicar la morfología en forma de flor de los HNF fabricados. Se incorporaron espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX, Tescan, MIRA II, República Checa) y mapeo elemental para determinar la composición y distribución espacial de los elementos en los HNF construidos, respectivamente. Se utilizó espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu, Equinox 55, Japón) para analizar grupos funcionales de constituyentes orgánicos e inorgánicos de HNF. Las muestras se dispersaron en discos de KBr prensados ​​y los espectros se registraron a 4000–400 cm-1. Se realizó un análisis Brunauer-Emmett-Teller (BET) (Microtrac, BELSORP MINI X, Japón) después de desgasificar las muestras en atmósfera de N2. Se llevaron a cabo análisis de difracción de rayos X (DRX) para identificar la fase cristalina del componente inorgánico utilizando un difractómetro de rayos X (Philips, PW1730, Philips, Eindhoven, Países Bajos).

La actividad de lacasa se midió espectroscópicamente seguido de la oxidación de ABTS como sustrato enzimático al catión radical ABTS•+ en tampón fosfato (10 mM, pH 4,5)33. Lacasa@Co3(PO4)2•HNF y la enzima libre se incubaron con 1 ml de solución ABTS (50 µM, pH 4,5) a 40 °C en una incubadora con agitador. Después de 15 minutos de incubación, se registró la densidad óptica de los sobrenadantes a 420 nm. Una unidad de actividad se definió como la cantidad de lacasa capaz de oxidar 1 µmol de ABTS al producto coloreado en 1 min. El efecto del pH y la temperatura sobre la actividad tanto de la lacasa@Co3(PO4)2•HNF como de la forma libre de lacasa se determinó en un rango de temperatura de 25–55 °C (intervalo de 10 °C) y un rango de pH de 2,5– 9,5 (intervalo 1) (n = 3, valor p < 0,05).

Después de preparar lacasa@Co3(PO4)2•HNF, se estimó la concentración de proteína residual en el sobrenadante mediante el método del ácido bicinconínico (BCA)34. La cantidad de enzima inmovilizada y el rendimiento de inmovilización (IY)7 se calcularon mediante la ecuación. (1) y la ecuación. (2), respectivamente.

donde MIL y ML son las cantidades de lacasa inmovilizada y añadida (μg) a la mezcla de inmovilización, respectivamente; CP y VIm representaron la concentración de proteína residual en el sobrenadante y el volumen de la mezcla de inmovilización.

donde Y0 e Y1 representan la cantidad de enzima inmovilizada en HNF antes y después del procedimiento de síntesis, respectivamente.

La eficiencia de inmovilización (IE) se obtuvo mediante la ecuación. (3), donde E0 y Et demuestran la actividad de la lacasa libre y lacasa@Co3(PO4)2•HNF, respectivamente.

Para evaluar la influencia de la inmovilización sobre la enzima aplicada, se evaluaron los parámetros cinéticos de lacasa@Co3(PO4)2•HNFs y lacasa libre. Para estudiar el efecto de la inmovilización sobre la actividad enzimática a diferentes valores de pH, se investigaron los parámetros cinéticos a pH 4,5 y 7,4. La actividad de las enzimas libres e inmovilizadas se determinó en presencia de concentraciones de ABTS (20–100 µM). Después de la adición de solución ABTS (pH 4,5 y 7,4) a las enzimas libres e inmovilizadas, la mezcla de reacción se incubó durante 15 minutos en una incubadora con agitador (a 40 °C) y se registró la densidad óptica del sobrenadante a 420 nm. . Se incorporó el diagrama de Lineaweaver-Burke para la evaluación de parámetros cinéticos como la constante de Michaelis (Km) y la velocidad máxima (Vmax). El número de rotación (Kcat) y la eficiencia catalítica también se calcularon con base en la ecuación. (4) y la ecuación. (5)35,36,37; donde [E] es la concentración de la enzima.

Para evaluar la reutilización del biocatalizador construido, se examinaron mediciones repetidas de la actividad de lacasa@Co3(PO4)2•HNFs21. Los HNF fabricados se incubaron en 1 ml de tampón fosfato (10 mM, pH 7,4) que contenía ABTS (0,5 mM) a 40 °C durante 15 minutos. Después de la centrifugación de la mezcla, se registró la DO420 del sobrenadante y los precipitados se lavaron tres veces con tampón fosfato (10 mM, pH 7,4). El procedimiento se repitió hasta el punto en que la actividad de los HNF cayó por debajo del 50% de su valor inicial (n = 3, valor de p <0,05). La estabilidad de la lacasa libre y los HNF se evaluó en función de la actividad recuperada después de 3 h de incubación a temperaturas que oscilaban entre 25 y 55 °C (intervalo de 10 °C) y un amplio rango de pH de 2,5 a 9,5 (intervalo 1). La estabilidad en almacenamiento de la lacasa libre y los HNF se obtuvo midiendo la actividad de la lacasa durante el almacenamiento a 4 °C (n = 3, valor de p <0,05).

Para evaluar los cambios conformacionales de la lacasa después de la inmovilización, se utilizaron dicroísmo circular (CD) de UV lejano y espectroscopías de fluorescencia. Los espectros CD de lacasa@Co3(PO4)2•HNF y la enzima libre se registraron mediante un espectrofotómetro Jasco 725 en una celda de 2 mm de longitud de paso, y la absorbancia se registró a 190–240 nm. La propiedad de fluorescencia del triptófano depende de la estructura terciaria de una proteína. En este sentido, la intensidad de fluorescencia del triptófano de la lacasa libre y lacasa@Co3(PO4)2•HNF se registró mediante un espectrofluorómetro Hitachi 850 después de la excitación a 285 nm33. Finalmente, el análisis termogravimétrico (TGA) se realizó utilizando un analizador termogravimétrico (Perkin Elmer STA 6000, EE. UU.) para la evaluación de la descomposición térmica tanto del fosfato de cobalto puro como de lacasa@Co3(PO4)2•HNF. El experimento se realizó bajo una atmósfera de N2 en un rango de temperatura de 25 a 600 °C con una velocidad de calentamiento de 10 °C min-1.

La moxifloxacina se incubó con lacasa@Co3(PO4)2•HNF y 1-hidroxibenzotriazol (HBT) como mediador de lacasa en tampón fosfato (10 mM, pH 4,5) a 40 °C en condiciones de agitación (100 rpm)38. Después de determinar el período de incubación, la concentración de moxifloxacina se cuantificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) junto con un detector de UV y el porcentaje de eliminación se calculó con base en la ecuación. (6); ya que C0 y Ct representan la concentración de moxifloxacina antes y después de los experimentos de eliminación/adsorción, respectivamente.

Para evaluar la adsorción de moxifloxacina en lacasa@Co3(PO4)2•HNF, el experimento se realizó con los HNF inactivados y la adsorción (%) se calculó mediante la ecuación. (5). Para ello, se inactivaron lacasa@Co3(PO4)2•HNF mediante ciclos secuenciales de congelación y descongelación. La inactivación se demostró mediante la medición de la actividad enzimática. Finalmente, la degradación de moxifloxacina se calculó con base en la Ec. (7).

Después del procedimiento de eliminación, el pH de la mezcla de reacción se ajustó a 7,95 (punto isoeléctrico de moxifloxacino) mediante tampón fosfato (100 mM, pH 7,95). Luego, la mezcla se extrajo con cloroformo en vigoroso vórtex tres veces después de la adición de ciprofloxacina como estándar interno. El cloroformo extraído se evaporó hasta sequedad mediante un rotavapor y el polvo restante se disolvió en 1 ml de la fase móvil de HPLC. Se incorporó un sistema Knauer HPLC-UV (Berlín, Alemania) para la cuantificación de moxifloxacina utilizando un detector PDA 2800, una bomba Smartline 1000 y el software ChromGate (versión 3.3.1). La fase móvil consistió en metanol (45%) y tampón fosfato 10 mM (pH 3,0) (55%). Las muestras se inyectaron mediante el muestreador automático Smartline 3950 en una columna de fase inversa Eurospher 100 C18 (250 × 4,6 mm).

Los productos de biotransformación de moxifloxacino se identificaron mediante cromatografía líquida acoplada a espectroscopia de masas (LC-MS). El aparato era un sistema LC Agilent serie 1200 acoplado con un instrumento MS tándem de tiempo de vuelo cuadrupolo Agilent 6520 presentado por una fuente de iones de electropulverización (Agilent, Waldbronn, Alemania). Se aplicó una columna Nucleosil 100-3 C18 HD de 2,1–100 mm (Macherey–Nagel, Düren, Alemania) con un caudal de 0,35 ml min-1. Como fase móvil se utilizó agua desionizada + ácido fórmico al 0,1% (40%) y acetonitrilo (60%).

Según estudios previos, la eliminación de la toxicidad no está garantizada por la degradación de los antibióticos en procedimientos catalíticos39. En consecuencia, se examinó la toxicidad de los productos de degradación de moxifloxacina contra algunas bacterias, incluidas Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Escherichia coli ATCC 25,922, Staphylococcus epidermidis ATCC 49,619 y Staphylococcus aureus ATCC 6538, que son responsables de la bioeliminación de contaminantes orgánicos en el medio ambiente. En este sentido, el cultivo fresco de cada bacteria se sembró en un caldo nutritivo y se incubó a 37 °C durante la noche. Luego, cada bacteria fue tratada con una mezcla de productos de degradación y se evaluó la densidad óptica (DO) de cada bacteria a 600 nm luego de determinar los períodos de incubación a 37 °C. La inhibición del crecimiento de los productos de degradación de la moxifloxacina, la moxifloxacina como control positivo y el agua estéril como control negativo se midieron trazando la DO600 frente al tiempo de incubación (n = 3, valor de p < 0,05)20.

Los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados se informaron como media ± desviación estándar. La significación estadística entre el valor medio de los resultados experimentales se calculó mediante ANOVA de dos factores (± desviación estándar) y el valor de p <0,05 se consideró significativo.

Los HNF se han construido rutinariamente con la adición de iones metálicos a PBS que contiene enzimas, seguido de una incubación de 3 días a temperatura ambiente, agitación vigorosa con vórtex o sonicación en baño, lo que introduce un estrés significativo al constituyente orgánico21,29,31,32. En el presente estudio, la concentración de CoCl2 y la molaridad del tampón fosfato (pH 7,4) se optimizaron para fabricar HNF instantáneamente y evitar la incorporación de condiciones que induzcan estrés en el procedimiento de síntesis. Después de la adición de CoCl2 al tampón fosfato que contenía lacasa, se formaron inmediatamente precipitados de color púrpura. El precipitado se lavó con agua desionizada tres veces y se denominó lacasa@Co3(PO4)2·HNFs. Como se muestra en la Fig. 1a, la actividad recuperada aumentó gradualmente con la molaridad más alta del tampón fosfato. Sin embargo, la mayor recuperación de actividad se obtuvo con HNF preparados con tampón fosfato 0,16 M y CoCl2 30 mM. En un estudio realizado por Zheng et al.40, se prepararon D-psicosa 3-epimerasa (DPEasa)@Co3(PO4)2•HNF mediante incubación de una solución que contenía Co2+ (1,9 mM), tampón fosfato (50 mM, pH 7,5) y DPEase (1 mg mL-1) a 4 °C durante 48 h. En otro estudio, se obtuvieron celobiosa 2-epimerasa (mutante E161D/N365P) (EDNP)@Co3(PO4)2•HNF mediante la adición de CoCl2 a PBS (10 mM, pH 7,4) y la incubación de la mezcla durante 24 h a temperatura ambiente41. La recuperación de actividad aumentó con la concentración de Co2+ en la mezcla de síntesis, y la recuperación de actividad más alta se logró con 2 mM de Co2+. En el presente estudio, la mayor actividad se obtuvo cuando la concentración final de Co2+ en la mezcla fue de 1,36 mM. Aunque la concentración de Co2+ incorporado en la mezcla de síntesis fue comparable a la de otros estudios, la molaridad del tampón fosfato utilizado en este estudio fue notablemente mayor. He et al.42 llevaron a cabo una interesante investigación sobre el mecanismo de formación de nanoflores de fosfato de cobre y también de BSA@Cu3(PO4)2•HNF. Se informó que al aumentar la concentración del tampón de fosfato incorporado (pH 7,4), aumentaba el rendimiento de nanoflores de fosfato de cobre. Se obtuvieron los mismos resultados en el presente estudio, y mediante la adición de CoCl2 a un tampón fosfato (5 mM, pH 7,4) que contenía lacasa, se formaron precipitados insignificantes y el rendimiento de lacasa@Co3(PO4)2·HNF se incrementó con la concentración del tampón fosfato. Por lo tanto, el rendimiento de HNF aumentó a concentraciones más altas de tampón fosfato. Sin embargo, a concentraciones de tampón fosfato superiores a 0,16 M, la recuperación de la actividad se redujo notablemente. Esto podría deberse a la formación de una mayor cantidad de cristales de fosfato de cobalto, lo que aumenta la limitación de la transferencia de masa. Para verificar el efecto de la incubación, el método más reportado para el crecimiento de HNF, los HNF optimizados se incubaron a 25 ° C durante 24 a 72 h. En estudios anteriores, la incubación se reemplazó con baño de sonicación, que aceleró el crecimiento de HNF29. Por lo tanto, los HNF preparados se sonicaron en un baño sonicador (60 kHz, 13,8 W) durante intervalos de tiempo determinados. Los resultados (Fig. 1b) demostraron que una mayor incubación redujo la actividad recuperada, lo que puede deberse a la desnaturalización de la enzima. Se informó que la ultrasonicación aumenta la tasa de autoensamblaje de fosfatos metálicos, lo que mejora el crecimiento de HNF29. La sonicación de la mezcla de reacción (hasta 20 min, intervalos de 5 min) no aumentó la actividad recuperada. Esto puede deberse a que se completó el crecimiento de lacasa@Co3(PO4)2•HNF en un período de tiempo relativamente corto; por lo tanto, una mayor incubación o sonicación no cambió la actividad recuperada. El método de síntesis mencionado se denomina "método concentrado" en el presente estudio para compararlo con los procedimientos tradicionales informados hasta ahora. La explicación actual del mecanismo de formación de HNF se basa en la nucleación de nanocristales de proteínas de fosfato metálico primario y el posterior crecimiento anisotrópico de los nanoagregados híbridos. Debido a la alta energía superficial de los nanocristales inorgánicos proteicos primarios, tienden a unirse y formar estructuras de nanoláminas, que finalmente forman la estructura final de los HNF22. El crecimiento de los sitios de nucleación de los HNF podría facilitarse aumentando la tasa de colisión de los cristales primarios43. Parece que la introducción de ciertas cantidades de energía cinética, proporcionada por la incubación a largo plazo (24-72 h a 25 °C), la sonicación en baño, el calentamiento por microondas y el esfuerzo cortante, a la mezcla de síntesis (componente orgánico, metal y iones fosfato) podrían inducir la formación de HNF. El número de sitios de nucleación primaria aumentó al incorporar una alta concentración de iones cobalto (II) y fosfato en la mezcla de reacción. Por lo tanto, con base en la Ec. (8), es posible que un mayor número de nanocristales colisionen entre sí con mayor frecuencia y los HNF se prepararon muy rápido43. En la ecuación. (8), z es la frecuencia de colisión, D es el diámetro de la partícula, ῡ representa la velocidad media de las partículas dispersas, N es el número total de partículas y V es el volumen total de la mezcla de reacción.

Optimización del procedimiento de síntesis. La síntesis de lacasa@Co3(PO4)2•HNF optimizando la concentración de iones fosfato y cobalto (II) (a), la influencia de la incubación (a 25 °C) como procedimientos tradicionales para la construcción de HNF en la actividad recuperada. del biocatalizador heterogéneo (b).

Se han sintetizado nanoflores híbridas en un corto período de tiempo mediante vigoroso vórtice30 y también sonicación en baño29 de los precursores, lo que aumentó la velocidad media de las partículas dispersas (ῡ). Basado en la ecuación. (8), después del aumento en la velocidad media de las partículas orgánicas-inorgánicas dispersas mediante agitación o sonicación en baño, la frecuencia de colisión aumenta, lo que resulta en un rápido crecimiento anisotrópico de los HNF.

La morfología en forma de flor de los HNF fabricados (Fig. 2a) se confirmó mediante una imagen SEM. El tamaño de lacasa @ Co3 (PO4) 2 • HNF osciló entre 0,5 y 3 µm y se ensambló mediante nanoláminas interconectadas, lo que dio como resultado una alta relación superficie-volumen (Fig. 2b). También se prepararon nanoflores de fosfato de cobalto (NF) mediante la misma ruta sintética sin la incorporación de lacasa en la mezcla de reacción. Como se muestra en las figuras S1 y S2, los fosfatos de cobalto • NF también exhibieron una morfología similar a una flor. Algunos de los estudios previos informaron que la morfología en forma de flor de los HNF se debe a la presencia de constituyentes inorgánicos44,45. Además, se informó que la estructura 3D del componente orgánico incorporado podría alterar la morfología de los HNF46. Sin embargo, el fosfato de cobre inorgánico se preparó mediante el mismo procedimiento de síntesis, que exhibió la misma morfología en forma de flor que la proteína @Cu3(PO4)2•HNFs42,47,48,49. Con todo, se podría concluir que algunos fosfatos metálicos tienen una morfología similar a una flor50 que podría modificarse tras la hibridación con proteínas. El análisis EDX de lacasa @ Co3 (PO4) 2 • HNF y nanoflores de fosfato de cobalto se exhiben en la Fig. 2d y la Fig. S4, respectivamente. El porcentaje en peso de elementos tanto en los HNF construidos como en el fosfato de cobalto se resume en la Tabla S1. La presencia de átomos de nitrógeno en los HNF preparados confirma la inmovilización de la lacasa en el soporte. El análisis del mapa elemental (Fig. 2c) también proporciona información sobre la distribución homogénea de los átomos de Co, P, N y O en los HNF construidos. Para identificar la parte inorgánica de lacasa@Co3(PO4)2•HNF, se realizó el análisis XRD. Los picos obtenidos de lacasa @ Co3 (PO4) 2 • HNF coincidieron con el patrón estándar de fosfato de cobalto (JCPDS 00–027-1120) (Fig. 3). El diámetro medio de los poros, el volumen total de los poros y el área de superficie específica de los HNF y Co3 (PO4) 2 • NF fabricados se resumen en la Tabla S2, y los gráficos BET correspondientes se muestran en la Fig. S5. La alta superficie específica (17,42 m2 g-1) está de acuerdo con el ancho nanométrico de los pétalos en la imagen SEM de lacasa@Co3(PO4)2. Como se muestra, el área de superficie específica de Co3(PO4)2•NF y los HNF sintetizados fue casi idéntica. La presencia de isoterma tipo IV en las gráficas BET se debe a la estructura mesoporosa de los materiales sintetizados. Como regla general, la mayor superficie de la enzima inmovilizada aumenta la accesibilidad del sustrato a la enzima y mejora la eficiencia biocatalítica51. Se informaron los mismos resultados para lacasa@Cu3(PO4)2•HNF (10,2 m2 g−1) y GOx@Cu3(PO4)2•HNF (17,9 m2 g−1)52,53. Los espectros FTIR de lacasa, Co3 (PO4) 2 y lacasa @ Co3 (PO4) 2 • HNF se representan en la Fig. 4a. Como se muestra, las frecuencias vibratorias características en la región 725-1300 cm-1 se deben a la presencia de grupos fosfato54. Los picos entre 2980 y 3600 cm-1 se atribuyeron a la presencia de grupos CH2 y CH3 en lacasa@Co3(PO4)2•HNFs54. La banda ancha en 3200–3500 cm−1 corresponde a la banda de estiramiento O–H55. Un pico a 1640 cm-1 se atribuye a la banda amida (I) de lacasa; sin embargo, se superpone con la banda de absorción de agua atrapada en lacasa@Co3(PO4)2•HNFs56,57.

Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM). Imagen SEM (a, b), mapa elemental (c) y análisis de espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDX) (d) de las lacasa@Co3(PO4)2•HNF construidas.

Análisis de difracción de rayos X (DRX). Espectro de rayos X de lacasa@Co3(PO4)2•HNF (a), patrón XRD de lacasa@Co3(PO4)2•HNF y el estándar Co3(PO4)2 (JCPDS–00–027–1120) (b) .

Análisis FT-IR. Los espectros de la espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) de lacasa@Co3(PO4)2•HNF (línea continua), Co3(PO4)2 (línea discontinua larga) y la enzima libre (guión-punto) (a). Reutilizabilidad de lacasa@Co3(PO4)2•HNF (b). La actividad de lacasa@Co3(PO4)2•HNF disminuyó a menos del 50% de la actividad inicial después de 11 ciclos de reutilización. Estabilidad en almacenamiento de lacasa @ Co3 (PO4) 2 • HNF y la lacasa libre después de 40 días de almacenamiento a 4 ° C (c). Bioeliminación de moxifloxacino por lacasa@Co3(PO4)2•HNF y lacasa@Co3(PO4)2•HNF inactivadas. Los experimentos se realizaron a 40 °C en tampón fosfato (10 mM, pH 4,5) (d).

Se aplicaron espectros de CD para dilucidar el efecto de la inmovilización en la estructura secundaria de lacasa (Fig. S6). Como se resume en la Tabla 1, la conformación de la lacasa nativa libre estaba compuesta principalmente por láminas β (44,4%), giros β (11,3%) y bobinas aleatorias (39,8%). Sin embargo, la cantidad de hélice α en la estructura secundaria de la lacasa aumentó notablemente (32%) después de la inmovilización de la lacasa en HNF a base de cobalto. El contenido de giros β disminuyó ligeramente; sin embargo, el contenido de láminas β (10,3%) de la lacasa se redujo significativamente. La lacasa de T. versicolor se compone principalmente de láminas β, giros β y otras estructuras, como se informó anteriormente58,59. Un mayor contenido de hélice α da como resultado una estructura proteica más rígida, que surge de la formación de un mayor número de enlaces de hidrógeno. Por lo tanto, al disminuir las láminas β y aumentar el contenido de hélice α, la estructura secundaria de lacasa se volvió más rígida60. A primera vista, no es descabellado que la actividad enzimática disminuya por completo después de tal alteración en la estructura de la proteína. Sin embargo, la inmovilización de enzimas puede cambiar significativamente la estructura de la proteína sin pérdida de actividad. Por ejemplo, mediante la preparación de agregados de enzimas reticulados, la estructura tridimensional de la enzima cambia notablemente. Se han utilizado agregados de lacasas reticuladas para la inmovilización de la enzima; mientras tanto, se conservó la actividad biocatalítica de la enzima61,62,63. Para verificar el efecto de cualquier cambio en la estructura terciaria de lacasa, se empleó espectroscopía de fluorescencia. El microambiente circundante influye en gran medida en las propiedades de fluorescencia del triptófano; en consecuencia, cualquier cambio en el microambiente del triptófano representa el plegamiento de proteínas. Como se muestra en la Fig. S7, la intensidad de fluorescencia de lacasa @ Co3 (PO4) 2 • HNF fue menor que la de la enzima libre, lo que indica el cambio considerable en la estructura de la enzima terciaria64. Los resultados indican que la inmovilización de lacasa en HNF de fosfato de cobalto aumenta el contenido de hélice α, lo que finalmente cambia la estructura terciaria de la proteína. Como se muestra en la Fig. S8, la pérdida de peso de lacasa @ Co3 (PO4) 2 • HNF fue mayor que la de las nanoflores inorgánicas puras, lo que indica que el 5% del peso de las HNF está compuesto de lacasa. La pérdida de peso total de lacasa@Co3(PO4)2•HNF tras la descomposición fue del 28,02%. La pérdida de peso inicial de las muestras (6% a 100-160 °C) se debió a la evaporación del agua cristalina atrapada en fosfato de cobalto. En la segunda etapa, la pérdida de peso se atribuye a la descomposición de lacasa inmovilizada, que fue del 22%.

Para determinar las condiciones óptimas para la actividad de lacasa@Co3(PO4)2•HNF, se midió la actividad enzimática en un amplio rango de pH y temperatura. Como se muestra en la Fig. 5a, b, la actividad de la lacasa @ Co3 (PO4) 2 • HNF en valores de pH básicos fue notablemente mayor que la de la enzima libre. Sin embargo, la actividad máxima tanto de la lacasa@Co3(PO4)2•HNF como de la enzima libre se obtuvo en un rango de pH de 4,5 a 5,5 y 45 °C. Patel et al.65 obtuvieron resultados similares ya que la actividad de las lacasas@Cu3(PO4)2·HNF reticuladas a pH 4–7 fue notablemente mayor que la de la enzima libre. La adaptación adecuada de la enzima al microambiente circundante explicó el aumento de la actividad de la lacasa en un rango de pH más amplio65. Sin embargo, se informó que los siguientes mecanismos son responsables de la mejora de la actividad de lacasa después de la inmovilización en HNF: (i) alta superficie y estructura porosa de los HNF, (ii) efecto alostérico del componente inorgánico en los sitios activos de la enzima, y ​​(iii ) conformación favorable de la enzima atrapada66,67. Es bien sabido que la inmovilización de enzimas sobre soportes con una alta superficie es favorable debido a la mayor carga de enzimas68. Además, la alta superficie de la enzima inmovilizada da como resultado un transporte de masa eficiente del sustrato a la enzima, por lo que se puede mejorar la actividad del biocatalizador69. Se informó que el efecto alostérico de los iones de cobre con lacasa mejora notablemente la actividad enzimática70. Además, la actividad catalítica de la α-amilasa inmovilizada en nanoflores de CaHPO4 mejoró debido al efecto alostérico del Ca2+. Sin embargo, el efecto alostérico del Co2+ sobre los sitios activos de lacasa no se había informado previamente. Por lo tanto, se podría concluir que la alta superficie de lacasa@Co3(PO4)2•HNFs redujo la limitación de la transferencia de masa, por lo que el sustrato accedió eficientemente al sitio activo de la enzima. Se cree que las altas temperaturas y el pH extremadamente ácido o básico reducen la actividad y estabilidad de las enzimas mediante la inducción de cambios conformacionales71. Sin embargo, se demostró que la hibridación de nitrilo hidratasa (NHasa) con complejos de fosfato de cobalto aumentaba la estabilidad de la NHasa frente a la temperatura72. De manera similar, la actividad de la lacasa aumentó en un 165% después de su incorporación a lacasa@Cu3(PO4)2•HNFs71. La coordinación estable de lacasa con fosfato de cobalto probablemente da como resultado una mayor estabilidad operativa de la enzima.

Estudios de estabilidad y actividad. Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad (a) y la estabilidad de la enzima libre (c). Influencia del pH y la temperatura sobre la actividad (b) y estabilidad de lacasa@Co3(PO4)2•HNFs (d).

Debido a la actividad enzimática mejorada de los HNF sintetizados en valores de pH básicos, las propiedades cinéticas de la lacasa inmovilizada y libre se evaluaron a pH 4,5 y 7,4. El rendimiento de la inmovilización, la eficiencia y las propiedades cinéticas de la lacasa@Co3(PO4)2•HNF preparada instantáneamente y la enzima libre se resumen en la Tabla 2. El IY (%) y el IE (%) fueron 65,3 ± 7,6 y 110 ± 4,9. que eran comparables con estudios anteriores. Se informó que la lacasa se inmovilizó en las estructuras organometálicas funcionalizadas con amino, que retuvieron el 93,8% de su actividad inicial. La carga de enzima (%) alcanzó ≈10% y ≈70% después de 1 h y 4 h de inmovilización, respectivamente73. También se inmovilizó lacasa sobre los gránulos de alúmina activada para la decoloración de las melanoidinas. El proceso de inmovilización involucrado en la incubación de lacasa con el soporte durante 5 h, y el IY (%) e IE (%) fueron del 87,5% y 97%, respectivamente74. Se prepararon lacasa-lisina@Cu3(PO4)2•HNF mediante la incubación de la mezcla de síntesis durante 72 h, y el IY (%) y la recuperación de la actividad fueron del 71% y 270%, respectivamente. Se informó que los HNF preparados exhibían actividad dual oxidasa y peroxidasa. La notable mejora de la actividad enzimática después de la inmovilización explicó el cambio conformacional favorable de la lacasa debido a la presencia de iones de cobre y lisina en la estructura de los HNF70.

La eficiencia de inmovilización, Vmax y Km de los biocatalizadores fueron diferentes en condiciones básicas y ácidas. El valor de Vmax de las lacasas@Co3(PO4)2•HNF a pH 7,4 fue un 40% mayor que a pH 4,5; sin embargo, la velocidad máxima de la enzima libre disminuyó un 21,2% a un pH de 7,4. Asimismo, la eficiencia del procedimiento de inmovilización se incrementó en un 25% a pH 7,4. Los resultados indicaron que la Kcat de lacasa@Co3(PO4)2•HNFs fue mayor que la de la enzima libre a pH 7,4; mientras que la enzima libre mostró una Kcat superior a la lacasa@Co3(PO4)2•HNF a pH 4,5. Estos resultados están alineados con el efecto del pH sobre la actividad de lacasa tanto libre como inmovilizada. La constante de Michaelis (Km) indica la afinidad de la enzima hacia el sustrato, y un valor bajo de Km indica la alta afinidad de la enzima hacia el sustrato en ambos valores de pH. La accesibilidad mejorada de lacasa@Co3(PO4)2•HNF al sustrato (en comparación con la enzima libre) podría atribuirse a la alta superficie de las estructuras en forma de flor que reduce las limitaciones de transferencia de masa75. Normalmente, Km, Vmax y las condiciones óptimas para que las enzimas alcancen la mayor eficiencia catalítica pueden alterarse después de la inmovilización76. Se ha informado que la actividad máxima de las lacasas fúngicas se puede obtener en un rango de pH de 3 a 577. Una de sus principales limitaciones es una actividad insuficiente en condiciones neutras y alcalinas a pesar del alto potencial redox de las lacasas fúngicas (490–790 mV). En este sentido, las lacasas tolerantes al pH son deseables para fines industriales y medioambientales78. La hibridación de lacasa con nanocristales de fosfato de cobalto mejoró la tolerancia de la lacasa de T. versicolor hacia condiciones alcalinas, lo que podría mejorar su conveniencia para aplicaciones industriales y ambientales79.

La reutilización es una característica importante de los biocatalizadores que reduce su costo de utilización, especialmente a escala industrial. Sin embargo, en el presente estudio, la medición de la reutilización de lacasa@Co3(PO4)2•HNF proporcionó evidencia sobre la inmovilización exitosa de lacasa en la matriz de fosfato de cobalto. Para evaluar la reutilización de lacasa@Co3(PO4)2•HNF, se midió consecutivamente la actividad enzimática mediante ABTS como sustrato. Como se muestra en la Fig. 4b, después de 4 ciclos de reutilización consecutivos, la actividad de las lacasas @ Co3 (PO4) 2 • HNF no cambió significativamente. Sin embargo, la actividad enzimática disminuyó al 50% de su valor inicial después de 10 ciclos de reutilización. Los resultados indican que las lacasas@Co3(PO4)2•HNF exhibieron una notable reutilización y la enzima se inmovilizó con éxito en la matriz de fosfato de cobalto. Los HNF a base de lacasa mostraron una reutilización prometedora; por ejemplo, los HNF de lacasa y lisina-cobre retuvieron el 60% de la actividad inicial después de 6 ciclos de reutilización81. En otro estudio, los HNF de lacasa-cobre retuvieron el 50% de la actividad inicial después de 10 ejecuciones de reutilización; sin embargo, los HNF tratados con glutaraldehído retuvieron casi el 100% de su actividad inicial en las mismas condiciones65. Como se muestra en la Fig. 5c, d, la estabilidad de la lacasa @ Co3 (PO4) 2 • HNF frente a temperaturas elevadas y valores de pH básicos fue mayor que la de la lacasa libre. Las lacasas@Co3(PO4)2•HNF retuvieron el 50% de su actividad después de la incubación a pH 9,5 durante 3 h, donde la lacasa libre casi perdió toda su actividad. Cabe señalar que la estabilidad de la lacasa@Co3(PO4)2•HNF fue menor que la de la enzima libre en valores de pH ácidos debido a la solubilidad del fosfato de cobalto en pH ácido 25. No hay datos disponibles para comparar. Como se mencionó en 3.3, el contenido de hélice α de lacasa aumentó después de la hibridación con fosfato de cobalto. Los iones de cobre de lacasa, que participan en la actividad catalítica de la enzima, están presentes en láminas β, que están compuestas principalmente de aminoácidos polares conservados82. Se ha informado que la estabilidad y la actividad de la lacasa aumentan cuando el contenido de la hélice α aumenta y las láminas β disminuyen20,60,83. Una estructura proteica más rígida alineada con el aumento del contenido de hélice α podría explicar la mayor estabilidad de las lacasas HNF que la enzima libre20. Sin embargo, se mejoró la estabilidad de las enzimas inmovilizadas sobre soportes a base de cobalto84. Por ejemplo, la lacasa se inmovilizó en los MOF basados ​​en Co2+ y Cu2+, lo que resultó en una mejora de su actividad enzimática. Los MOF lacasa-Co2+ y lacasa-Cu2+ retuvieron el 66 % y el 58 % de su actividad inicial después de 4 semanas de almacenamiento a temperatura ambiente, lo que indica la estabilización superior de la lacasa por el MOF85 basado en Co2+. La estabilidad térmica de la lacasa mejoró después de su incorporación en lacasa@Cu3(PO4)2•HNFs71. En otro estudio, se inmovilizó lacasa en nanopartículas de CoFe2O4, Fe3O4 y NiFe2O4. Lacasa-CoFe2O4, lacasa-Fe3O4, lacasa-NiFe2O4 y la lacasa libre retuvieron ≈80%, ≈70%, ≈40% y 0% de su actividad inicial, respectivamente, después de 30 días de incubación a 25°C86. Se informó que el 43% y el 22% de lacasa@Cu3(PO4)2•HNF y la enzima libre, respectivamente, se retuvieron después de 30 minutos de incubación a 80 °C. Se informó que la estabilidad conformacional y la rigidez de la lacasa inmovilizada eran responsables de la estabilización de la lacasa. Se sintetizaron HNF de óxido de grafeno-lacasa para la eliminación eficiente del tinte violeta cristal (CV) y rojo neutro (NR). Después de 60 min de incubación a 70 °C, la lacasa libre e inmovilizada conservaron el 57% y el 71% de su actividad inicial, respectivamente75. La inmovilización de lacasa en lacasa@Co3(PO4)2•HNF aumentó la estabilidad de almacenamiento de la enzima. Como se muestra en la Fig. 4c, después de 40 días de almacenamiento a 4 ° C, los HNF preparados perdieron el 20% de la actividad inicial, mientras que la enzima libre perdió el 58% de la actividad inicial.

Como se muestra en la Fig. 4d, las lacasas @ Co3 (PO4) 2 • HNF pudieron eliminar significativamente la moxifloxacina. El antibiótico fue eliminado casi por completo (99%) por los HNF fabricados de la mezcla de reacción mediante mecanismos de degradación y adsorción. Para determinar específicamente la adsorción de moxifloxacino en los HNF construidos, el antibiótico se trató con lacasa inmovilizada desactivada. Por lo tanto, la cantidad de eliminación de moxifloxacina mediante lacasa@Co3(PO4)2•HNF desactivadas se tuvo en cuenta para el mecanismo de adsorción. La adsorción en la superficie de los HNF fue responsable del 24% de la eliminación de moxifloxacina después de 18 h de tratamiento, y se encontró que la capacidad de adsorción máxima de lacasa@Co3(PO4)2•HNF desactivada para este antibiótico fue de 0,8 mg g-1. En un estudio reciente, se eliminó la doxorrubicina de la orina humana utilizando nanoflores magnéticas de fosfato de cobre. Se informó que al formar complejos con el anillo de aglicona y el resto de azúcar de la doxorrubicina, iones metálicos como Cu(II), Fe(II o III) y Mn(II) podrían unirse a este antibiótico antitumoral49. Anteriormente se informó que los iones metal2+ podrían formar complejos con antibióticos similares a las quinolonas a través de un mecanismo de complejación con grupos 4-oxo y carboxilo adyacentes de la fracción quinolona. Por lo tanto, la complejación de antibióticos tipo quinolona con iones metálicos2+ podría usarse para su adsorción87,88. Como lo muestran Wu et al. 89, la montmorillonita y la caolinita adsorbieron el ácido nalidíxico a través de la complejación con el grupo carboxilo C-3 (OH) y el grupo oxo C-4 de esta fluoroquinolona sintética. La capacidad máxima de adsorción de montmorillonita y caolinita para ácido nalidíxico fue de 24 y 1,03 mg g-1, respectivamente89.

Como se muestra, la degradación de moxifloxacina por lacasa@Co3(PO4)2•HNF alcanzó una meseta después de 18 h de tratamiento y representó el 75% de su eliminación. La eliminación de moxifloxacino por lacasa no se ha informado previamente; sin embargo, la lacasa eliminó eficazmente otros antibióticos similares a las quinolonas, como la ciprofloxacina y la ofloxacina90,91,92. En este estudio, la lacasa@Co3(PO4)2•HNF eliminó la moxifloxacina en presencia de HBT, un mediador de lacasa. Varios tipos de productos farmacéuticos no pueden ser degradados por las lacasas, como los antibióticos tipo quinolona, ​​debido a su alto potencial redox (E°)93. Se han aplicado sistemas lacasa/mediador (LMS) para superar esta limitación aumentando el potencial de oxidación de la lacasa hacia E° altos de compuestos orgánicos93. Los radicales libres generados mediante la oxidación de mediadores por la lacasa pueden oxidar eficientemente una amplia variedad de sustancias orgánicas. De hecho, los mediadores actúan como lanzaderas redox entre los sitios activos de lacasa y sustratos con alto potencial redox94. Con la adición de HBT, el 40% y el 75% de la moxifloxacina se degradaron después de 6 y 24 h de tratamiento, respectivamente. Se informaron los mismos resultados para la degradación de isobutilparabeno (iso-BP) y n-butilparabeno (n-BP) mediante el sistema de oxidación lacasa/HBT. Como la lacasa no pudo eliminar la iso-BP y la n-BP, fueron eliminadas casi por completo mediante el sistema lacasa/HBT (2 mM)95. En otro estudio, se utilizó lacasa de Coriolopsis gallica UAMH8260 para la degradación de algunos tintes textiles. Se informó que la enzima podría decolorar 13 tintes textiles sintéticos; sin embargo, el sistema lacasa/HBT (1 mM) pudo eliminar eficientemente 26 tintes textiles96.

Después del procedimiento de bioeliminación, la mezcla de productos biotransformados de moxifloxacina se sometió a análisis LC-MS. Los principales subproductos, sus tiempos de retención y la relación masa-carga correspondiente (m/z) se presentan en la Fig. S9. Con base en los resultados de LC-MS, se proponen cinco vías plausibles para la degradación de moxifloxacino (Fig. 6). Curiosamente, el biocatalizador reemplazó los átomos de flúor de la moxifloxacina, que es responsable de la baja biodegradabilidad de las FQ, con grupos hidroxilo (compuesto III; m/z + 1 = 262, Rt = 6 min)90. Como se muestra, la apertura del anillo del resto de piperazina y otras reacciones de desmetilación fueron responsables de la aparición del compuesto VI (m/z = 307, traza) y el compuesto II (m/z + 1 = 280, Rt = 3,9 min), respectivamente (vía I ). En la vía II, la moxifloxacina experimentó desfluoración y escisión del resto piperazina (compuesto VII; m/z = 388, traza) y se transformó adicionalmente en el compuesto V (m/z = 358, Rt = 9,8 min) después de la dihidroxilación y desmetilación97. En la tercera vía, mediante oxidación y apertura del anillo de piperazina, se formó el compuesto VIII (m/z = 418, traza), que finalmente se convirtió en el compuesto IV (m/z = 294, Rt = 8,7 min) después de pasos de oxidación posteriores. En la siguiente vía, se formó el compuesto VIII (m/z = 418, trazas) y, mediante la escisión completa del grupo piperazina, el compuesto I se transformó en el compuesto IX (m/z = 307, trazas) que se transformó en el compuesto IV ( m/z = 294, Rt = 8,7 min) después de la desmetilación y craqueo del anillo de ciclopropano (vía IV). En el mecanismo final propuesto, el átomo de flúor de moxifloxacina se sustituyó por OH (compuesto X, m/z = 400, trazas) y además, mediante pérdida del grupo piperazina y desmetilación, se convirtió en el compuesto III (m/z + 1 = 262, Rt = 6 min) (vía V).

Mecanismo de degradación de moxifloxacino. Vías de biotransformación de moxifloxacina propuestas por lacasa @ Co3 (PO4) 2 • HNF.

Los procedimientos de degradación no siempre garantizan la disminución de la toxicidad de los contaminantes; incluso hay informes sobre un aumento de la toxicidad de los contaminantes después de su degradación98,99. Para examinar la eficacia de los HNF sintetizados, se evaluó la toxicidad de la moxifloxacina y sus metabolitos contra cuatro cepas bacterianas. Como se muestra en la Tabla S3, la toxicidad de los productos de degradación disminuyó efectivamente después del tratamiento con lacasa@Co3(PO4)2•HNF. El tratamiento de moxifloxacina con los HNF construidos redujo el % del IG para P. aeruginosa en un 67 %. La reducción del IG (%) para S. aureus, S. epidermidis y E. coli fue del 24,6 %, 48,7 % y 12 %, respectivamente. Algunos de los productos de degradación de las FQ exhibieron actividad antimicrobiana. Debido a la mejora de la actividad de la ADN girasa por el flúor, la desfluoración de la moxifloxacina redujo significativamente su actividad biológica. Además, la mayoría de los productos de degradación identificados poseen una menor hidrofobicidad, lo que puede limitar su difusión a través de la membrana celular97,100,101.

Este estudio informó sobre un enfoque sencillo para la síntesis instantánea de HNF denominado "método concentrado". Al contrario de los procedimientos de síntesis informados anteriormente, se incorporaron altas concentraciones de iones fosfato y cobalto para la síntesis de HNF. La formación de sitios de nucleación primarios (nanocristales proteicos inorgánicos) y su crecimiento anisotrópico fueron los principales pasos involucrados en la síntesis de HNF mediante este método. La fabricación rápida de HNF se logró aumentando la cantidad de nanocristales primarios, lo que mejoró su tasa de colisión y aceleró el crecimiento de los HNF. Por lo tanto, la síntesis de lacasa @ Co3 (PO4) 2 • HNF no implicó tiempos de incubación prolongados (12 a 72 h) ni condiciones duras como la ultrasonicación y la agitación con vórtices. La eficiencia catalítica, los parámetros cinéticos y la estabilidad de la lacasa mejoraron después de la inmovilización de la enzima en HNF. Sin embargo, el rendimiento de la inmovilización no fue muy alto (65,3%) en comparación con los trabajos publicados anteriormente, lo que puede reducir la rentabilidad del método de inmovilización. Según los espectros de CD y fluorimetría, un mayor contenido de hélice α de lacasa@Co3(PO4)2•HNF que la enzima libre es responsable de la mayor estabilidad de los HNF construidos. En este estudio se presentó por primera vez la capacidad de la lacasa inmovilizada para eliminar la moxifloxacina. El antibiótico se eliminó mediante mecanismos de adsorción y biodegradación, y la toxicidad de los productos de degradación contra dos bacterias G+ y dos G- fue menor que la de la fluoroquinolona original. Sin embargo, la toxicidad de los productos de degradación contra S. aureus (18,5%) y E. coli (8,8%) se redujo ligeramente. El método descrito para la síntesis de lacasa@Co3(PO4)2•HNF podría usarse para la síntesis de una amplia gama de HNF utilizando diversos componentes orgánicos e inorgánicos. Explorar la formación de HNF a base de lacasa con diferentes metales arrojará luz sobre la interacción de la lacasa con los fosfatos metálicos en estado sólido. Además, el conocimiento actual del mecanismo de formación de HNF es actualmente limitado y se necesitan más estudios para explorar nuevos métodos para la síntesis de HNF basados ​​en lacasa.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

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Este trabajo fue apoyado financieramente por la subvención número 1400-2-104-54845 del Centro de Investigación Biotecnológica de la Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán, a MAF.

Estos autores contribuyeron igualmente: Khashayar Vojdanitalab y Hossein Jafari-Nodoushan.

Departamento de Biotecnología Farmacéutica, Facultad de Farmacia y Centro de Investigación en Biotecnología, Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, PO Box 14155−6451, Teherán, 1417614411, Irán

Khashayar Vojdanitalab, Hossein Jafari-Nodoushan, Somayeh Mojtabavi, Mahtab Shokri y Mohammad Ali Faramarzi

Centro de Investigación en Ciencias Farmacéuticas, Subdivisión de Ciencias Médicas de Teherán, Universidad Islámica de Azad, Teherán, Irán

Khashayar Vojdanitalab, Mahtab Shokri y Hoda Jahandar

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KV: conceptualización, metodología, investigación y redacción—borrador original. HJ: curación de datos, redacción: preparación de borradores originales, visualización y software. SM: análisis formal, redacción: revisión y edición, y conceptualización. MS: visualización, investigación y metodología. HJ: software, validación e investigación. MAF: supervisión, conceptualización, metodología, recursos, curación de datos, redacción: revisión y edición, administración de proyectos y adquisición de fondos.

Correspondencia a Mohammad Ali Faramarzi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Vojdanitalab, K., Jafari-Nodoushan, H., Mojtabavi, S. et al. Síntesis instantánea y caracterización completa de nanoflores híbridas de lacasa-fosfato de cobalto orgánico-inorgánico. Informe científico 12, 9297 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13490-w

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Recibido: 11 de febrero de 2022

Aceptado: 25 de mayo de 2022

Publicado: 03 de junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13490-w

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Investigación en ciencias ambientales y contaminación (2022)

Biodegradación (2022)

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